Переходные экспрессии генов в табак с помощью Gibson Ассамблею и генной пушки

Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении транзиентной экспрессии репортерного белка с GFP-меткой в клетках эпидермиса листа табака. Для этого сначала разрабатывается ДНК-конструкция, которая будет экспрессироваться в хлоропластах и пероксисомах. Затем конструкция собирается с помощью ПЦР-амплификации и сборки по Гибсону.

Затем с помощью генной пушки конструкция доставляется в эпидермальные клетки листа табака. В итоге при исследовании листа табака методом конфокальной микроскопии обнаруживается экспрессия GFP в хлоропластах и пероксисомах. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как классическое клонирование, является отсутствие необходимости в использовании рестриктаз, благодаря чему может быть клонирована любая последовательность, доступная для амплификации с помощью ПЦР.

Благодаря гибкости генетического дизайна область применения данных методов расширяется до более крупных масштабов. Генная инженерия сельскохозяйственных культур. Начните выполнение данного протокола с определения участков внутри растительной клетки для окончательной экспрессии белка. В данной работе целью является направление экспрессии в хлоропласты, пероксисомы и цитозоль.

Затем разработайте экспрессионную конструкцию. Конструкция должна содержать промотор, детектируемый ген и терминатор в составе одной плазмиды. В данном случае конститутивный промотор P end cup two управляет экспрессией GFP, за которой следует терминатор Nolene Synthe или nos t.

Обратите внимание, что в данном эксперименте мы будем тестировать серию трит-тегов (trit tags) — один, два и три, экспрессируемых на C-конце GFP для экспрессии в хлоропластах и пероксисомах. Метод сборки по Гибсону основан на действии нескольких ферментов в готовой смеси, которые частично переваривают концы двухцепочечной ДНК и способствуют отжигу комплементарных оснований соседних последовательностей ДНК. Конечная конструкция состоит из трех частей, которые должны быть амплифицированы в четырех реакциях ПЦР перед сборкой по Гибсону.

В ходе первой и второй реакций амплифицируется плазмидный вектор PORE размером 8,000 bp, содержащий GFP NOS T и маркер устойчивости к канамицину. Маркер устойчивости является подходящим участком для разделения этой крупной молекулы ДНК на два более коротких шаблона, которые легче амплифицировать методом ПЦР. В третьей реакции амплифицируется промотор P end cup two, а в четвертой — triag one; с помощью программного обеспечения для дизайна in silico, такого как ape design, конструкция была разработана поосновочно таким образом, чтобы между каждым фрагментом имелся перехлест длиной 50 bp.

При заказе праймеров для ПЦР можно использовать перекрытие в 50 пар оснований, так что праймеры будут иметь длину 25 пар оснований в каждом направлении. После проведения ПЦР для амплификации каждого компонента очистите продукты ПЦР по отдельности и разведите их в дистиллированной деионизированной воде. Если в качестве матрицы для ПЦР использовалась мини-препарация из e coli, обработка рестриктазой DpnI позволит удалить contaminating template DNA. Затем измерьте концентрацию каждого фрагмента ДНК.

Доведите концентрацию вектора до приблизительно 150 nanograms per microliter для каждой собираемой конструкции, включая контроль, возьмите аликвоту 15 microliter смеси для сборки по Гибсону (Gibson Assembly mix) из морозильной камеры и разморозьте ее на льду. С помощью бесплатного онлайн-инструмента @gibbon. org определите объемы для эквимолярных количеств каждого из фрагментов.

Добавьте рассчитанный объем каждого из фрагментов в 15 µL смеси для сборки по Гибсону. Также подготовьте контрольный образец, содержащий только векторную ДНК. Общий объем каждой реакции должен составлять 20 µL.

При необходимости доведите объем до требуемого значения с помощью воды. Инкубируйте пробирки при температуре от 50 до 55 °C в течение 30–60 минут. После инкубации снова поместите пробирки на лед.

Извлеките из морозильника при температуре -80 °C микроцентрифужную пробирку, содержащую коммерческий препарат компетентных клеток e coli в 200 µL хлорида кальция, и слегка согрейте ее в руке. Затем добавьте все 20 µL реакционной смеси к клеткам e coli. Инкубируйте культуры на льду в течение 30 минут, после чего перенесите их в водяную баню при температуре 42 °C для теплового шока продолжительностью 60 секунд.

Не используйте электрокомпетентные клетки. Относительно высокая концентрация соли и низкая концентрация ДНК могут вызвать электрический пробой клеток. После трансформации поместите культуры на ЛЁД на две минуты, затем добавьте 750 µL среды SOC или LB и оставьте их для восстановления на 30 минут при 37 °C.

Затем смесь высевают на чашки с LB-средой, содержащей канамицин или другой подходящий антибиотик, и инкубируют при 37 °C в течение ночи; 10 колоний подвергают скринингу с помощью секвенирования. Обратите внимание, что данный метод может привести к более высокому уровню фонового шума и большему количеству нецелевых событий рекомбинации, чем традиционное клонирование на основе лигирования. Биобаллистическая трансфекция табака с помощью генной пушки была ранее описана в JoVE.

Ниже приведен обзор основных этапов и отличий от предыдущих протоколов. После амплификации и выделения конструктов подготовьте микрочастицы для генной пушки, как описано в статье JoVE по методу woods и zeto, и загрузите их в генную пушку для трансфекции эпидермальной ткани листа табака Nicotiana benhamiana. Выберите крупный лист, расположенный близко к основанию растения в возрасте от трех до пяти месяцев.

Используя соответствующие средства защиты глаз и органов слуха, осторожно поместите лист нижней стороной вверх на влажные бумажные полотенца в чашку Петри диаметром 15 сантиметров. Установите давление гелия в генной пушке на 200–250 PS.I и аккуратно направьте её между жилками на нижней стороне листа с расстояния примерно три-пять сантиметров. Снимите предохранитель и произведите обстрел листа частицами.

Применяйте каждый патрон дважды в одном и том же месте на листе. Перейдите к другому участку и повторите процесс; если лист разрывается, утилизируйте его и возьмите новый лист. Прочность листа может варьироваться в зависимости от условий роста, таких как возраст, влажность и т. д.

После завершения всех инъекций накройте лист и храните его в течение двух-трех дней при слабом освещении на лабораторном столе. Осмотрите лист с помощью диссекционного микроскопа, оснащенного УФ-флуоресценцией, чтобы найти отдельные клетки, экспрессирующие GFP. При обнаружении клеток, экспрессирующих GFP, с помощью диссекционных ножниц аккуратно вырежьте фрагменты листа размером от 5 до 10 мм.

Немедленно погрузите каждый отдельный фрагмент листа в лунку глубокого предметного стекла, содержащую около 200 µL 0,1% Triton X 100. Детергент помогает предотвратить образование пузырьков воздуха на поверхности, а глубокое предметное стекло позволяет визуализировать более обширную область ткани; для получения изображений клеток используйте конфокальный микроскоп, оснащенный соответствующими фильтрами и 40 x водяным иммерсионным объективом. В данном исследовании три различных конструкции для таргетинга GFP в органеллы сравнивали с немаркированным GFP и rubis.Coag.

Конфокальная микроскопия GFP использовалась для обнаружения флуоресценции GFP в транзиентно трансформированных одиночных клетках в контрольных экспериментах, в которых экспрессировался немаркированный GFP. Флуоресценция наблюдается только в ядре и цитозоле, но не в хлоропластах, которые определяются по красной автофлуоресценции хлорофилла, как показано на этом примере клетки, трансфицированной только Rubis Oag, локализованным в хлоропластах. Конструкт GFP был экспрессирован в крупных органеллах.

Клетка обведена белым цветом. Желтый цвет указывает на области колокализации конструкта с хлорофиллом, что свидетельствует о таргетировании конструкта в хлоропласт; как показано на данном изображении одной трансфецированной клетки triag one, экспрессия GFP наблюдается в хлоропластах, на периферии, в цитозоле и в небольших точечных органеллах, которые, как полагают, являются пероксисомами. Аналогично, в трансфецированных клетках triag two GFP также экспрессируется в хлоропластах, цитозоле и пероксисомах; triag three, который состоит из сигнала пероксисомы, встроенного в область низкой сложности последовательности хлоропласта, локализуется только в хлоропластах и пероксисомах.

Обратите внимание, что эта клетка находится в другом слое листа. На данном рисунке обобщены данные об экспрессии, наблюдаемой в компартментах типичной эпидермальной клетки листа табака. Показаны относительные размеры и расположение структур внутри клетки, а также уровни относительной экспрессии, зафиксированные с помощью трансфекции генной пушкой и конфокальной микроскопии.

Обратите внимание, что немаркированный GFP локализуется в цитозоле и ядре, контрольный PIMT two GFP локализуется в хлоропластах, а triag one GFP, triag two GFP и Triag 3G FP локализуются в хлоропластах и пероксисомах, как и ожидалось. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как сконструировать плазмиду с помощью сборки по Гибсону, доставить ее баллистическим методом в листья табака и пронаблюдать экспрессию GFP в течение трех дней. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости использования 150 ng/µL векторной ДНК для сборки по Гибсону и 1500 ng/µL вашего конечного ДНК-конструкта для приготовления микрочастиц для генной пушки. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как трансфекция с помощью Agrobacterium, для получения стабильной, а не транзиторной экспрессии гена.