Генерация Myospheres Из ЭСК эпигенетическими Перепрограммирование

Общая цель этой процедуры — создание сфер миоса. БЭ-подобные структуры, состоящие из скелетных мышечных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека. Это достигается путем перепрограммирования клеток лентивирусной инфекцией Baf 60 C. Вторым этапом процедуры является заражение тех же клеток вторым вирусом, лентивирусом myo D.

Затем инфицированные клетки индуцируют к образованию ЭБ-подобных агрегатов в течение пяти дней в питательной среде на основе сыворотки. Затем среду EB заменяют на среду для дифференцировки без сыворотки, и агрегаты в течение еще двух недель выращивают в миос-сферы. В конечном счете, иммунофлуоресценция используется для визуализации срезов встроенных ОКТ агрегатов.

Основным преимуществом этой методики является высокопродуктивная дегенерация скелетных мышечных клеток, которая, подобно происхождению из мезенхимальных или мезодермальных предшественников, не требует сортировки фактов и поэтому совместима с трехмерной культуральной системой. За день до заражения эмбриональных стволовых клеток человека в шести луночных планшетах добавить в среду клонирование эмбриональных стволовых клеток человека и восстановительную добавку в 1000 раз для конечной концентрации в два микромоляра. день инфицировать эмбриональные стволовые клетки человека с высоким титром ванны 60 CGFP лентивирусом. Сначала диссоциируйте лунку с клетками в одноклеточную суспензию, добавив один миллилитр требухи и инкубируя пластину в течение пяти минут. Затем соберите и переложите суспензию в 15 миллилитровую трубку.

Добавьте девять миллилитров подготовленной среды и раскрутите клетки со скоростью 1200 об/мин в течение пяти минут, ожидая до миллилитра SIR, одного. Добавьте полимозг в концентрации шесть микрограммов на миллилитр и добавку для восстановления эмбриональных стволовых клеток человека в концентрации два микромоля.

Затем повторно суспендируйте элементы в этом растворе и перенесите их в одну лунку с шестью лунками с низким прикреплением пластины. Теперь добавьте в ванну концентрированный вирус 60 С при кратном заражении 100 миллионов. Инкубируйте тарелку в течение трех часов с вирусом.

Затем соберите ячейки и разделите их на две лунки, покрытые матригелевыми пластинами. В каждую тарелку добавьте по два миллилитра mt, SIR, один с двумя микромолярными добавками, а затем инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день замените носители на свежие.

Клетки будут казаться уже слипшимися через 48 часов с момента начала инфекции. Проверьте флуоресценцию, чтобы оценить эффективность инфекции. Продолжайте ежедневные изменения среды до тех пор, пока уровень конфлюенции клеток не достигнет 80%, затем диссоциируйте клетки и вирус myo D в клетках, используя тот же протокол.

Поддерживайте инфицированные клетки с ежедневными изменениями среды до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния за день до этой точки роста. Пластина MES на пластинах с матригелевым покрытием при давлении 1000 клеток на квадратный сантиметр для прохода инфицированных клеток к пластине ME'S. На следующий день.

Используйте трип АЛИ, чтобы диссоциировать их и перенести клетки в 15-миллилитровую трубку к клеткам. Добавьте девять миллилитров среды для эмбриональных стволовых клеток человека и центрифугируйте их. Добавьте 1 200 об/мин в течение пяти минут.

Ресуспендируйте гранулированные клетки в свежих шести миллилитрах среды эмбриональных стволовых клеток человека. Теперь извлеките среду из двух тарелок mes и добавьте к ним зараженные клетки. Инкубируйте клетки в течение нескольких дней.

Один раз добавьте 80% confluence. Удалите все среды и добавьте четыре миллилитра коллагеназы. Добавьте один миллиграмм на миллилитр через пять минут в коллагеназу при 37 градусах Цельсия.

Замените коллагеназу миллилитром среды для эмбриональных стволовых клеток человека. Затем под микроскопом для вскрытия соскребите колонии с помощью наконечника пипетки объемом 10 миллилитров, перенесите колонии в пробирку объемом 15 миллилитров и дайте им осесть. Через три минуты удалите надосадочную жидкость и суспендируйте клетки в среде эмбриональных стволовых клеток человека.

Затем поместите клетки в соотношении один к четырем к метамфетаминовым пластинам. Инфицированные клетки должны быть в большом количестве и иметь сформированные колонии хорошего качества для этой процедуры. Удалите среду из каждой лунки и добавьте по одному миллилитру коллагеназы. Четыре.

Добавьте один миллиграмм на миллилитр концентрации, как и раньше, и коллагеназа вступит в реакцию через пять минут, заменив ее на среду EB. А затем быстро с помощью микроскопа наскрести колонии. С помощью наконечника для пипетки объемом 10 миллилитров можно диссоциировать клетки на мелкие клеточные скопления.

Соберите эти агрегаты в 15-миллилитровую пробирку, и после того, как они осядут около трех минут, удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в трех миллилитрах EB-среды и перенесите все в одну лунку шестилуночной пластины с низким прикреплением. Инкубируйте эту тарелку на ночь на следующий день. Проверьте их на наличие больших колоний.

Если таковые будут найдены. Разбейте их, пропустив через пятимиллилитровую пипетку несколько раз. Если плавающих одиночных ячеек много, соберите заполнители путем осаждения и замените их свежей средой для ЭБ.

Заменяйте среду через день после пяти дней культивирования. Соберите клеточные агрегаты и промойте их один раз двумя миллилитрами PBS, позволив клеткам осаждаться под действием нормальной силы тяжести. Затем замените PBS тремя миллилитрами среды DM и верните клетки в те же лунки планшета в течение следующих 15 дней культивирования.

Заменяйте среду каждые три дня. За это время сформируются мезосферы. Человеческие эмбриональные стволовые клетки были инфицированы ванной температурой 60 °C, несущей флуоресценцию GFP.

Через 72 часа в ячейках были отсортированы факты. Клетки, экспрессирующие BAF 60 C, выращивали до примерно 75% бегучести, а затем инфицировали лентивирусом myo D. Экспрессия экзогенных генов была обнаружена в инфицированных клетках с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

Изучали экспрессию и распределение на уровне белка. Далее GFP соответствует экспрессии baf 60 C, и для проверки экспрессии myo D использовали антитело myo D. Через 15 дней после эмбриона человека эмбриональные стволовые клетки начали образовывать БЭ агрегаты.

Часть миозных сфер была встроена в ОКТ-соединение и разрезана на секцию, окрашенную положительно на маркеры миогенных и тяжелых цепей миозина. Начиная с 10-го дня, можно было наблюдать спорадическое сокращение в миосных сферах. Некоторые миос-сферы принимали различные или необычные формы, возможно, из-за слияния между миос-сферами.

Этот метод будет способствовать развитию исследований в области моделирования и терапии заболеваний, поскольку миосферы могут быть созданы из плюрипотентных стволовых клеток пациентов с различными мышечными расстройствами. По этой причине миосферы предоставляют модель болезни в редакции, подходящую для очистки от лекарств и патогенеза болезни.