Адаптация полуавтоматического циркулирующих опухолевых клеток (СТС) Анализы для клинических и доклинических исследований приложений

Этот эксперимент направлен на чуткое обнаружение, перечисление и характеристику циркулирующих опухолевых клеток из образцов крови человека и мыши. Во-первых, соберите образцы крови у людей и/или мышиных моделей рака и с помощью положительного отбора EPCA-позитивных клеток обогащайте ЦОК на фоне загрязняющих лейкоцитов. Затем с помощью дифференциального окрашивания ЦОК и лейкоцитов идентифицируют и подсчитывают ЦОК.

Выполните желаемую молекулярную характеристику этих редких циркулирующих опухолевых клеток в лаборатории, чтобы помочь в выборе таргетной терапии для онкологических пациентов в клинике. Результаты, полученные с помощью системы клеточного поиска, демонстрируют, что анализ КТК может быть эффективно выполнен как в образцах крови человека, так и в образце крови мышиного ксенотрансплантата. Разработка дополнительных пользовательских протоколов определения характеристик ЦОК в системе клеточного поиска может в конечном итоге помочь в выборе таргетной терапии для пациентов.

Кроме того, сопоставимые анализы СТК, адаптированные для использования в ксенотрансплантатах мышей, улучшат наше понимание базовой биологии этих клеток. Соберите 7,5 миллилитров образца крови из пробирки с консервантом A CTC и медленно выдавите его в пробирку для обработки. Добавьте 6,5 миллилитров разбавляющего буфера в каждый образец крови.

Переверните пять раз, чтобы перемешать, и центрифугируйте при 800-кратном G в течение 10 минут. После перерыва в выключенном положении для контрольной подготовки осторожно переведите флакон в течение пяти секунд и переверните пять раз для перемешивания. Затем снимите крышку крышки с помощью перевернутой обрабатывающей трубки и одним быстрым движением перенесите образец.

Осторожно поверните боковые стороны контрольного флакона для максимального переноса образца. Осторожно извлеките перевернутый контрольный флакон, следя за тем, чтобы жидкость не потерялась. Соберите оставшееся содержимое из флакона и крышки и аккуратно добавьте в технологическую пробирку.

Следуйте инструкциям на экране прибора для подготовки, чтобы загрузить все контрольные образцы и образцы пациента в систему для обработки. Следуйте инструкциям на экране прибора для подготовки, чтобы выгрузить все образцы из системы. Теперь неплотно закройте каждый картридж магнитного устройства и постучите, чтобы выпустить пузырьки с краев.

Затем плотно закупорьте картридж, положите магнитное устройство плашмя и выдерживайте в темноте не менее 20 минут. Включите инструмент анализа и инициализируйте лампу. Загрузите картридж для проверки системы в прибор для анализа.

Выберите вкладку «Тест контроля качества» и следуйте инструкциям на экране, чтобы выполнить необходимые меры контроля качества. Затем загрузите образец в инструмент для анализа и выберите вкладку «Тест пациента». Нажмите кнопку «Пуск», чтобы инициализировать сканирование образца.

При необходимости отрегулируйте все края с помощью клавиш направления. Затем выберите accept Чтобы получить определенные пользователем маркеры, разведите интересующее антитело с помощью разбавителя первичного антитела Bond. Поместите стаканчик с маркерным реагентом в первое место в картридже с реагентом и загрузите картридж в систему поиска клеток, чтобы обеспечить пользовательское добавление маркера.

Выберите определяемый пользователем анализ по запросу прибора для подготовки. Введите имя маркера и нажмите кнопку Сохранить. После завершения обработки образца загрузите образец на прибор для анализа и выберите вкладку «Настройка».

Чтобы инициализировать канал ZI, выберите CTC для поиска ячеек в качестве идентификатора набора в разделе протокола тестирования. В этом меню выберите исследование CTC. Нажмите кнопку редактирования и установите желаемое время экспозиции.

Соберите не менее 50 микролитров крови мыши в пробирку для фиксатора ЭДТА объемом один миллилитр и перемешайте путем инверсии, чтобы предотвратить свертывание крови. Для обогащения ЦОК переложите эквивалент 50 микролитров цельной крови в проточную цитометрическую пробирку. Добавьте 500 микролитров разбавляющего буфера в каждый образец.

Смыв кровь с боковых сторон пробирки, аккуратно смочите антихимическую жидкость и добавьте 25 микролитров к каждому образцу. Также добавьте 25 микролитров реагента для усиления захвата. Аккуратно перебейте образцы в вихревой поток и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.

Далее поместите пробирки с образцами в магнит на 10 минут. Осторожно отасуньте остаточную жидкость, не касаясь стенки пробирки рядом с магнитом, и выбросьте, снимите пробирки с образцом от магнита и добавьте 50 микролитров красителя нуклеиновой кислоты. 50 микролитров окрашивающего реактива, 1,5 микролитра анти-US CD 45 A PC, 5,0 микролитров анти-человеческого HLA LOR 4, 88 и 100 микролитров проницаемого реагента вихрь бережно инкубировать в темноте в течение 20 минут.

При комнатной температуре. Теперь добавляем 500 микролитров разбавляющего буфера и вортекса. Аккуратно поместите пробирки с образцами в магнит на 10 минут.

Осторожно отсасывайте остатки жидкости и выбросьте. Затем повторно суспендируйте гранулы в 350 микролитрах разбавляющего буферного вихря и аккуратно перемешайте. Отасуньте образец в гелевый наконечник и перенесите его в магнитное устройство, начиная с нижней части картриджа и медленно извлекая наконечник по мере выдачи образца.

После удаления пузырьков воздуха с помощью стерильной иглы 22 калибра плотно закройте картридж, положите магнитное устройство плашмя и выдержите в темноте не менее 10 минут. Загрузите образец на прибор для анализа и выберите вкладку настройки. Чтобы очистить существующие данные, нажмите кнопку форматирования образца.

Выберите CTC для поиска клеток в качестве идентификатора набора и исследование CTC в качестве протокола тестирования. В этом меню убедитесь, что выбрано соответствующее время экспозиции. Выберите вкладку «Тест пациента» и нажмите кнопку «Изменить».

Чтобы ввести информацию об образце, введите оставшуюся необходимую информацию, как указано. Затем сохраните информацию о образце и нажмите кнопку «Начать» для проверки. Восстановление циркулирующих опухолевых клеток, клеток рака предстательной железы человека с шипами и образцов крови человека от здоровых доноров-добровольцев обрабатывались в системе поиска клеток с использованием стандартного протокола CTC для поиска клеток.

Как и ожидалось, в образцах с шипами не было циркулирующих опухолевых клеток. Извлечение ЦОК для образцов с шипами составило 86,9%Эти изображения галереи поиска клеток, полученные из образцов с шипами, имеют оптимальное качество, и ЦОК легко отличить от не-ЦОК. Идентификация ЦОК у больных раком немного сложнее, поскольку многие клетки кажутся меньшими по размеру и их труднее отличить от не-ЦОК.

Кроме того, при рассмотрении образцов пациентов шесть категорий событий представляли собой обычно расхождения между зрителями. Это небольшие события, ZI-положительные события, тусклый цитокератин или пятнистое окрашивание, пикселизированные изображения, просвечивание цитокератина и большие или неперекрывающиеся dpi. Выбор набора CTC должен быть рассмотрен при разработке определяемых пользователем маркеров с использованием клеточной линии, которая, как известно, демонстрирует 98-4% положительности для маркеров раковых стволовых клеток CD 44.

Набор CTC на основе FCI классифицировал только 69,3% CTC как CD-44-положительные. Тем не менее, при использовании набора CX C на основе ПЭ 98,8% ЦОК были классифицированы как CD 44 Положительная подходящая оптимизация любого определяемого пользователем маркера требует валидации с использованием высокой плотности антигена, низкой плотности антигена и отрицательных клеточных линий для интересующего маркера для обеспечения чувствительности и специфичности анализа. В этом эксперименте оценивается чувствительность и специфичность адаптированного протокола поиска клеток мыши.

Как и ожидалось. Образцы с шипами не содержали ЦОК при использовании обоих анализов и извлечения ЦОК. При использовании адаптированного комплекта мыши и стандартной автоматизированной системы были получены сопоставимые изображения, полученные с использованием ручного мыши, адаптированный протокол не отличался от наблюдаемых с использованием стандартной автоматизированной методики.

Добавление HLA fit E к этому анализу гарантирует, что опухолевые клетки человека можно легко отличить от плоских эпителиальных клеток мыши, серийное разведение образцов крови мышей с шипами, а также корреляция ожидаемого количества клеток по отношению к восстановленному количеству клеток. Убедитесь, что этот метод так же чувствителен, как и стандартный протокол CSS, для выделения небольшого количества CTC. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять автоматическое и ручное обогащение ЦОК из образцов крови человека и человека.

Кроме того, вы должны лучше понимать шаги, необходимые для разработки и оптимизации протоколов определения характеристик CTC для использования в сочетании с системой поиска клеток.