Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью Микобактерии туберкулеза Усиление микрочипов
25 апреля 2014 г.
Усиление микрочипов сочетает асимметричный ПЦР-амплификации и микрочипов гибридизации в одной камеры, что значительно упрощает микрочипов рабочий процесс для конечного пользователя. Упрощение микрочипов рабочий процесс является необходимым первым шагом для создания микрочипов методы диагностики, которые могут быть обычно используются в средах ниже ресурсами.
Общая цель данного эксперимента заключается в генотипировании микробактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью с использованием амплификационного микрочипа. Это достигается за счет проведения мультиплексной асимметричной ПЦР поверх микрочипа в одной микрофлюидной реакционной камере. Там образец одновременно амплифицируется, выбирается помеченный размер, делается одноцепочечным и гибридизуется с микрочипом.
Затем, после промывки микрочипа, считыватель показывает, присутствует ли микробактерия туберкулеза и содержит ли она мутацию ДНК, которая, как известно, придает устойчивость к рифампицину изо, ниязи этамбутолу или стрептомицину. Преимущество этого метода по сравнению с существующими методами линейного зонда на микрочипе или гибридизации нуклеиновых кислот заключается в том, что амплификационный микрочип значительно упрощает взаимодействие пользователя с испытуемым. Тем не менее, обеспечивая аналитическую чувствительность ПЦР и способность мультиплексирования микрочипа, для этой процедуры необходимо обеспечить чистое рабочее место, протертое дезинфицирующим раствором, и нуклеиновые кислоты, достаточно чистые для мультиплексной ПЦР.
После размораживания и смешивания всех исходных растворов соберите мастер-смесь для ПЦР. При приготовлении этой смеси приготовьте хотя бы один дополнительный объем смеси для показанного здесь теста на туберкулез. Также добавьте в мастер-смесь дополнительную Т-полимеразу.
В дополнение к количеству липких веществ, прилагаемых к исходным реактивам, смешайте один микролитр аликвот образца ДНК на 49 микролитров мастер-смеси. Осторожно добавьте по 48 микролитров каждой реакционной смеси в центр соответствующего микрочипа. Не прикасайтесь к самому микрочипу.
Затем тщательно накройте и запечатайте микрочип неправильно. Применение защитного стекла может привести к образованию пузырьков, которые могут привести к артефактам, испарению, плохой амплификации или неравномерной гибридизации. Любое из этих условий может привести к ошибочному результату.
Далее загрузите микроставку в термоамплификатор. Когда подложка прижата к нагревательному блоку, опция с подогревом крышки должна быть отключена. Для лабораторий, которые следуют универсальным мерам предосторожности ПЦР, более эффективно использовать несколько амплификационных микрочипов на предметное стекло и обрабатывать несколько тестов одновременно.
Теперь запустите соответствующую программу термоциклирования. Эта программа имеет 50 циклов амплификации, что может показаться высоким, но необходимым из-за преимущественно одноцепочечной популяции ампликонов, создаваемой реакцией. Когда реакция завершится, извлеките микрочипы и выключите термоамплификатор.
Осторожно откройте камеру микрочипа с помощью плоских щипцов и щипцов. Снимите крышку, крышку и прокладку. Микрочип может быть поврежден на этом этапе, поэтому будьте осторожны неправильно.
Снятие узла прокладки может привести к физическому повреждению микрочипа. Будьте осторожны, чтобы не согнуть и не сгибнуть защитное стекло, и будьте очень осторожны, чтобы не поцарапать поверхность микрочипа щипцами. Купайте субстраты в промывном буфере в течение 10 минут при комнатной температуре с легким помешиванием, после ванны с промывочным раствором сделайте еще два или три промывки, все в деионизированной воде.
Высушите микрочипы, прежде чем приступать к визуализации. Для этой цели в данной демонстрации можно использовать слабый поток сжатого воздуха, параметры которого специфичны для теста MDR TB и портативного тепловизора Econ DX 2100. Синий индикатор на тепловизоре указывает на то, что он готов.
Включите компьютер. Откройте системное программное обеспечение, предоставленное устройством, и подождите, пока программное обеспечение объявит о том, что оно установило соединение с камерой. Далее вставьте высушенный микрочип в тепловизор.
С микрочипом по направлению к линзе и от пользователя. Теперь программное обеспечение будет предоставлять изображение предварительного просмотра из выпадающего меню. Выберите сценарий анализа MDR TB.
Введите время воздействия от 100 до 500 миллисекунд. Будут считаться переэкспонированные пиксели. Отрегулируйте экспозицию, чтобы свести их к минимуму.
Если насыщенность настроена на минимизацию передержки, начните анализ. Программное обеспечение размещает сетку MDRT TB на изображениях, образцах и интенсивности фона, а затем сообщает о лекарственной устойчивости и результатах генотипирования. После завершения анализа и сохранения извлеките микросхему из имидж-сканера и начните новый сеанс анализа для анализа следующего массива.
Продолжите анализ для каждого из обработанных микрочипов. Сохранение данных каждый раз. Качественный анализ изображений может дать представление об источниках экспериментального шума или изменчивости, которые сложно выявить в таблицах данных, созданных программным обеспечением для автоматизированного анализа изображений.
Здесь виден высококачественный массив без артефактов. Несколько артефактов могут привести к появлению пузырей, которые создают ореолы. Несмотря на артефакты массива, программное обеспечение все равно будет извлекать значения из сканирования.
Алгоритм диагностических отчетов, несмотря на полученные значения, признал бы этот массив недействительным. На ПЦР-матрице микрочипа использовали серию разведения геномной ДНК дикого типа H 37 RA с массой 6,25 пикограмма, что эквивалентно 1 250 клеткам. Все щупы были обнаружены.
Значение SNR выше трех является положительным результатом, а зарегистрированные значения были намного выше. Затем были генотипированы референтные изоляты Всемирной организации здравоохранения. Однонуклеотидные полиморфизмы, присутствующие на матрице, были обнаружены в виде соответствующей мутации в геноме МЛУ ТБ.
Также было очевидно несколько примеров обнаружения мутаций у ближайших соседей. Обсуждение предусмотрено в текстовом протоколе. После освоения этот метод может быть выполнен примерно за три с половиной или шесть с половиной часов, в зависимости от концентрации ДНК, конкретного анализа, эффективности и однородности термоамплификатора, а также желаемой аналитической или клинической чувствительности и специфичности.
Кроме того, количество циклов амплификации и время гибридизации после амплификации могут быть легко сокращены или удлинены для получения желаемых эксплуатационных характеристик.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод амплификационного микрочипа для генотипирования микробактерий *Mycobacterium tuberculosis* с множественной лекарственной устойчивостью. Благодаря интеграции асимметричной ПЦР-амплификации и гибридизации на микрочипе в одной камере рабочий процесс значительно упрощается, что делает данный метод подходящим для использования в условиях ограниченных ресурсов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Генетика
- Диагностика
Теоретические основы
- Микробактерии tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью представляют собой серьезную проблему для общественного здравоохранения.
- Традиционные методы детекции могут быть сложными и ресурсозатратными.
- Существует потребность в упрощенных методах диагностики для условий с ограниченными ресурсами.
- В данном исследовании изучается новый подход с использованием амплификационных микрочипов.
Цель исследования
- Разработать метод генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.
- Упростить взаимодействие пользователя с диагностическим тестом.
- Объединить процессы амплификации и гибридизации в единую микрофлюидную реакцию.
Используемые методы
- Мультиплексная асимметричная ПЦР, проводимая на микрочипе.
- Одновременная амплификация, маркировка, селекция по размеру и гибридизация.
- Промывка микрочипа после гибридизации.
- Использование ридера для обнаружения Microbacterium tuberculosis и связанных с ней мутаций.
Основные результаты
- Метод амплификационного микрочипирования упрощает процесс диагностики.
- Он сохраняет аналитическую чувствительность ПЦР.
- Он обеспечивает возможность мультиплексирования, сопоставимую с традиционными микрочипами.
- Результаты указывают на эффективное выявление мутаций лекарственной устойчивости.
Выводы
- Амплификационный микрочип является перспективным инструментом для диагностики туберкулеза.
- Данный метод может расширить возможности тестирования в условиях ограниченных ресурсов.
- Для широкого применения необходимы дальнейшая валидация и оптимизация.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод микрочипа с амплификацией упрощает генотипирование MDR-TB путем интеграции асимметричной ПЦР, маркировки и гибридизации в одной микрофлюидной камере, что сокращает количество ручных операций и позволяет применять метод в условиях ограниченных ресурсов. Этот подход сохраняет чувствительность на уровне ПЦР, обеспечивая при этом мультиплексное обнаружение мутаций, вызывающих резистентность, что открывает путь к упрощенной масштабируемой диагностике для эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями. Минимизируя взаимодействие с пользователем и время обработки, данный метод устраняет критические пробелы в рабочих процессах трансляционной микробиологии, где скорость, воспроизводимость и низкая зависимость от инфраструктуры имеют решающее значение для валидации мишеней на ранних стадиях и разработки анализов.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать генетические мишени, связанные с механизмами лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis.
- Практическая ценность: Облегчает проверку гипотез за счет мультиплексного детектирования SNP в одной реакции, что снижает вариативность, возникающую при разделении образцов.
- Трансляционная ценность: Предоставляет релевантную для заболевания систему оценки мутаций, обеспечивающих устойчивость, что помогает снизить механистические риски в программах по поиску мишеней для противоинфекционных препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественные сигналы гибридизации, которые коррелируют с аллельными вариантами, что позволяет осуществлять аллель-специфическую дискриминацию.
- Практическая ценность: Сочетает амплификацию и детекцию в закрытой системе, что минимизирует риск контаминации и повышает воспроизводимость между сериями анализов.
- Готовность метода: Использует 9-плексную асимметричную мастер-смесь, совместимую с массивами низкой плотности, демонстрируя масштабируемое мультиплексирование для панелей генотипирования патогенов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Прямое генотипирование штаммов МЛУ-ТБ с использованием референтных изолятов ВОЗ, что обеспечивает клиническую значимость выявленных мутаций.
- Прогностическая достоверность: Достижение SNR >3 в качестве порога положительного результата, что служит количественным критерием для оценки эффективности анализа.
- Непрерывность рабочего процесса: Результаты генотипирования совместимы с последующими алгоритмами интерпретации резистентности, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочие процессы от раннего поиска до доклинических исследований, обеспечивая быстрый анализ генотипирования в закрытой системе, что позволяет принимать обоснованные решения по валидации мишеней и оптимизации соединений-лидеров в программах разработки противоинфекционных препаратов.
- Фундаментальные исследования: облегчает изучение механизмов резистентности на уровне путей за счет обнаружения множественных мутаций в таких генах, как rpoB, katG и embB.
- Скрининг: обеспечивает высокопроизводительное профилирование штаммов с минимальными временными затратами на ручные операции, что позволяет проводить скрининг клинических изолятов или мутагенных библиотек.
- Аналитика: обеспечивает мультиплексное флуоресцентное считывание для количественной оценки эффективности гибридизации, что позволяет сравнивать содержание мутантных аллелей при различных условиях.
- Трансляционные исследования: использует клинически значимые объемы вводимой ДНК (вплоть до эквивалента 1,000 клеток), что позволяет перейти от тестирования синтетических образцов к образцам, полученным от пациентов.
- Корпоративное повторное использование: формат микрофлюидного амплификационного микрочипа может быть адаптирован под другие панели патогенов, что способствует повторному использованию платформы для различных целей в области инфекционных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при генотипировании резистентности за счет одновременного мультиплексного детектирования мутаций.
- Операционная ценность: Исключает раздельные этапы амплификации и гибридизации, сокращая время непосредственной работы и техническую вариабельность.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более быстрое принятие решений о целесообразности дальнейших действий при валидации мишени, предоставляя профили резистентности в течение 6,5 часов.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию соединений, нацеленных на резистентные штаммы, с учетом рисков посредством надежного генотипирования доклинических изолятов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрофлюидными системами и оптимизацией асимметричной ПЦР для обеспечения равномерности амплификации.
- Зависит от наличия амплификаторов с регулируемыми настройками крышки и совместимых приборов для флуоресцентного имиджинга с целью конечного детектирования.
- Необходимы стандартизированные протоколы промывки для предотвращения переноса загрязнений между запусками при серийной обработке.
- Необходимо учитывать ограничения по совместимости праймеров в мультиплексных мастер-смесях, так как степень мультиплексирования ограничена совместимостью пар праймеров, а не плотностью зондов.
- Эффективность зависит от качества и концентрации вводимой ДНК, что требует контроля качества геномного материала перед амплификацией.
