Оценка Морфин-индуцированной гипералгезии и обезболивающее толерантности в мышей с использованием тепловых и механических Ноцицептивная Механизмы
29 июля 2014 г.
Мы опишем протокол для изучения развития опиоидной индуцированных гипералгезии и толерантности у мышей. На основе измерения тепловых и механических ноцицептивных реакций наивных и морфина обработанных животных, он позволяет количественно оценить увеличение болевой чувствительности (гипералгезии) и снижение обезболивания (допуска), связанного с хронической администрации опиатов.
Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении за развитием опиоидной гипералгезии и толерантности к анальгетикам у мышей. Это достигается путем измерения термических и механических ноцицептивных реакций у наивных мышей после введения морфина в течение определенного периода времени в нулевой день в качестве второго этапа. Ноцицептивный порог измеряется ежедневно перед введением морфина на седьмой день.
Анализируемый анальгетический эффект морфина снова измеряется в динамике для выявления развития толерантности к анальгетикам. Полученные результаты демонстрируют повышение чувствительности к боли, а также развитие толерантности к анальгетикам после повторного введения морфина.
Хотя данный метод позволяет изучить развитие гиперчувствительности к боли и толерантности к анальгетикам у мышей, после хронического введения опиатов его также можно применять к другим опиатам или генетически модифицированным мышам. Процедуру продемонстрирует аспирант моей лаборатории. Чтобы минимизировать анальгезию, вызванную стрессом, с мышами проводят манипуляции по пять минут ежедневно и приучают их к фиксатору до тех пор, пока они не начнут заходить в него свободно.
После привыкания к условиям эксперимента начните тест с погружением хвоста, установив термостат на 48 °C. Осторожно поместите мышь в фиксатор. После надежной фиксации погрузите выступающие две трети хвоста в водяную баню и запустите хронометр.
Разграничение между ноцицептивным стимулом и ноцицептивной реакцией является ключевым элементом данной процедуры. Правильная оценка и отработка навыка имеют решающее значение для успеха. Следите за движениями животного и остановите хронометр.
Как только мышь отдернет хвост из горячей воды, зафиксируйте время задержки отдергивания. Верните мышь в клетку и протестируйте следующее животное в том же порядке до конца серии. Повторите измерения ноцицептивного ответа еще два раза.
Латентность ноцицептивного ответа в секундах для каждой мыши определяется как среднее значение трех последовательных определений. Для проведения теста с давлением на хвост сначала осторожно поместите мышь в фиксатор и расположите ее хвост под коническим наконечником анализатора JMeter. После установки нажмите педаль, чтобы приложить равномерно возрастающее давление на проксимальную часть хвоста.
При первых признаках ноцицептивной реакции уберите наконечник. Ноцицептивные ответы могут включать попытки вырваться, писк или отдергивание хвоста. Зафиксируйте текущую силу в граммах, вызывающую ноцицептивный ответ.
Повторите данное измерение на срединной и дистальной частях хвоста той же мыши с интервалом в 32 секунды, затем верните животное в домашнюю клетку и повторяйте эти действия, пока не будут протестированы все мыши. Сначала разделите животных на две группы с сопоставимыми средними значениями ноцицепции. Затем измерьте и запишите массу тела каждого животного.
После формирования групп с физраствором и морфином приготовьте раствор морфина в физиологическом растворе для подкожного введения. Измерьте латентные периоды ноцицептивного ответа в тестах с погружением хвоста и давлением на хвост, зафиксировав эти значения как время 0,0 для каждой группы. Затем введите морфин или физраствор каждому животному в соответствии с его группой.
Через 30 минут начните регистрацию ноцицептивных ответов у каждого животного. Обращайте особое внимание на пороговые значения, так как на этом раннем этапе мыши вряд ли отреагируют на вредоносные стимулы. При отсутствии ноцицептивной реакции используется 25-секундный порог отсечки для предотвращения повреждения тканей при соблюдении той же последовательности тестов.
Повторяйте измерения ноцицепции каждые 30 минут в течение 3,5 часов после инъекции при хроническом введении морфина. Получите значения за первый день, измерив ноцицептивный ответ животных на TIT и TPT, как было продемонстрировано ранее. Приготовьте свежий раствор морфина.
Введите инъекции морфина или физиологического раствора в соответствии с распределением по группам и оставьте животных в покое до следующего дня. На следующий день измерьте ноцицептивные реакции с помощью TIT и TPT перед введением второго раунда инъекций. Повторяйте эти действия ежедневно в течение шести дней.
На седьмой день оцените анальгезию, вызванную морфином. Согласно временной парадигме, продемонстрированной ранее в тесте погружения хвоста, максимальный анальгезирующий эффект морфина достигался через 30 минут. Однако в тесте давления на хвост максимальный эффект наблюдался через 60 минут по сравнению с контрольной группой, которой вводили физиологический раствор.
Эти результаты показывают, что ежедневные инъекции морфина в течение семидневного периода лечения вызывали значительное и прогрессирующее снижение базовых показателей термической и механической ноцицепции. После хронического лечения базовый показатель ноцицепции у мышей, получавших морфин, был значительно ниже, чем у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор. После острого введения морфина ноцицептивный ответ в группе с хроническим введением морфина значительно увеличился, но лишь незначительно превысил базовый показатель ноцицепции в контрольной группе, получавшей физиологический раствор.
Для мышей, обследованных через 30 минут в TIT и TPT, а также через 60 минут в TIT, здесь представлены графики значений ноцицептивного порога, измеренных через 30 минут после инъекции физиологического раствора или морфина, для нулевого и седьмого дней развития. Этот метод открыл исследователям в области изучения боли возможность изучать влияние фармакологического или генетического вмешательства на развитие гиперчувствительности к боли и толерантности к анальгетикам, вызванных хроническим введением морфина.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол изучения опиоидной гиперalгезии и толерантности к анальгетикам у мышей. Путем измерения термических и механических ноцицептивных реакций в протоколе количественно определяются изменения чувствительности к боли и анальгезии после хронического введения морфина.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Фармакология
- Поведенческая наука
Теоретические основы
- Опиоид-индуцированная гипералгезия представляет собой феномен, при котором у пациентов наблюдается повышенная чувствительность к боли после терапии опиоидами.
- Толерантность к анальгетикам возникает при снижении эффективности опиоидов с течением времени.
- Понимание этих механизмов имеет решающее значение для совершенствования стратегий купирования боли.
- В данном исследовании используется мышиная модель для изучения этих эффектов в контролируемых условиях.
Цель исследования
- Наблюдение за развитием опиоидной гипералгезии у мышей.
- Измерение аналитической толерантности, возникающей в результате хронического введения морфина.
- Изучение механизмов гиперчувствительности к боли.
Используемые методы
- Мышам вводили морфин, после чего измеряли их ноцицептивные реакции с помощью тестов погружения хвоста в горячую воду и давления на хвост.
- Измерения проводились ежедневно в течение семи дней для оценки изменений болевой чувствительности.
- Для количественной оценки гипералгезии и толерантности оценивали как термические, так и механические пороги.
- Результаты сравнивали между группой, получавшей морфин, и контрольной группой, получавшей физиологический раствор.
Основные результаты
- Хроническое введение морфина привело к значительному повышению чувствительности к боли.
- Наблюдалась толерантность к анальгетикам, выражавшаяся в снижении эффективности морфина с течением времени.
- Результаты измерений указали на прогрессирующее снижение ноцицептивных порогов у мышей, получавших морфин.
- Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что хроническое применение опиоидов приводит к гиперalгезии и развитию толерантности.
Выводы
- В исследовании представлен надежный метод оценки опиоидной гипералгезии и толерантности у мышей.
- Результаты подчеркивают необходимость тщательного контроля опиоидной терапии для предотвращения повышения чувствительности к боли.
- Данный протокол может быть адаптирован для дальнейших исследований других опиоидов или генетических модификаций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Опиоид-индуцированная гипералгезия и толерантность к анальгетикам представляют собой серьезные проблемы при разработке анальгезирующих препаратов, снижая долгосрочную эффективность опиоидной терапии. Данный протокол позволяет снизить механические риски путем количественной оценки сдвигов термической и механической ноцицепции in vivo, что способствует валидации мишеней и повышает прогностическую уверенность в кандидатах в анальгетики. Этот подход предоставляет релевантную заболеванию систему для оценки генетических и фармакологических модификаторов ответа на опиоиды, что помогает при сортировке портфеля препаратов и идентификации ведущих соединений-кандидатов в исследованиях боли.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем измерения двунаправленных изменений термической и механической ноцицепции после хронического воздействия морфина.
- Практическая ценность: Обеспечение функциональной валидации мишеней посредством количественной оценки фенотипов гипералгезии и толерантности у мышей дикого типа и генетически модифицированных мышей.
- Прогностическая ценность: Повышение прогностической достоверности за счет установления дозо- и времязависимых взаимосвязей между воздействием опиоидов и сдвигами порога ноцицепции.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления базовых профилей ноцицептивного ответа и профилей, измененных под действием препаратов.
- Количественные показатели: Получение воспроизводимых непрерывных данных (латентный период отдергивания в секундах, сила в граммах), что позволяет проводить стандартизированную оценку соединений в различных исследованиях.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для тестирования кандидатов в анальгетики, генетических вмешательств или комбинированной терапии в рамках единой системы измерения ноцицепции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует опиоид-индуцированную гипералгезию и толерантность — основные ограничения клинической опиоидной терапии, обеспечивая согласование трансляционных биомаркеров гиперчувствительности к боли.
- Преклиническая непрерывность: Связывает этап поиска с последующими исследованиями посредством лонгитюдного отслеживания ноцицепции, что позволяет принимать обоснованные решения о продвижении препарата на основе показателей устойчивости анальгезирующего эффекта.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет изолировать переменные, способствующие развитию толерантности к анальгетикам, в отличие от гипералгезии, что помогает в выборе мишеней и стратегии поиска биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки анальгетиков — от ранней валидации мишени и оптимизации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, что позволяет проводить итеративную оценку потенциала анальгезии и терапевтического индекса.
- Открывательная биология: Обеспечивает проверку гипотез о модуляции ноцицептивных путей и биологическое снижение рисков для мишеней опиоидов посредством лонгитюдного профилирования чувствительности.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных количественных измерений термической и механической ноцицепции, подходящих для оценки библиотек соединений.
- Аналитика: Предоставляет данные о временном ходе и сравнении групп (морфин против физиологического раствора, острое против хронического воздействия), что позволяет провести статистическую оценку развития толерантности к анальгетикам.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает доклиническую валидность путем моделирования клинически значимых фенотипов опиоидной гипералгезии и толерантности у мышей.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для ноцицептивного фенотипирования, применимую для различных классов опиоидов, генетических моделей и исследований терапевтического вмешательства.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет уменьшения механистической неопределенности при изучении опиоидной гипералгезии и толерантности путем прямого лонгитюдного измерения ноцицепции.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет привыкания, слепого метода измерения и усреднения латентного периода по трем повторам для термических и механических воздействий.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления потенциальных проблем с анальгетическим эффектом, что снижает вероятность неудач на поздних этапах из-за непредвиденной гипералгезии или толерантности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов в анальгетики с учетом рисков, основываясь на устойчивости эффекта и его отличии от признаков гипералгезии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с грызунами, проведения тестов на ноцицепцию и дифференциации рефлекторных и аффективных болевых реакций для обеспечения достоверности данных.
- Метод зависит от наличия откалиброванного оборудования для термического (водяная баня 48°C) и механического (градуированный стимулятор давления) воздействия с возможностью точного измерения латентного периода и силы воздействия.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов привыкания, процедур инъекций и времени проведения измерений для минимизации вариабельности между операторами.
- При применении метода на моделях крыс или видах, отличных от мышиных, требуются корректировки в связи с различиями в морфологии хвоста и ноцицептивной чувствительности.
- Практические ограничения включают возможность развития стресс-индуцированной анальгезии при недостаточном привыкании, а также «эффект потолка» при измерении ноцицепции при экстремальных дозах препаратов.
