Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Общая цель этой процедуры — получить изображение дендритных шипиков в сверхвысоком разрешении. Это достигается путем предварительной подготовки первичного гиппокампа крысы, называемого вторым этапом визуализации дендритных шипиков с помощью трансфекции и окрашивания GFP. Далее осуществляется получение меченых GFP дендритных шипиков в сверхвысоком разрешении с помощью SIM-микроскопа.

Последним шагом является реконструкция исходных данных изображения в 3D, готовое к последующему анализу изображения. В конечном счете, GFP, экспрессирующий первичные нейроны гиппокампа, визуализированный в сверхвысоком разрешении, используется для демонстрации тонких изменений в морфологии дендритного шипика. Основное преимущество этой методики перед существующими методами вроде обычной конфокальной микроскопии, заключается в том, что она позволяет более детально изучить морфологию дендритного шипика.

Этот метод может помочь изучить ключевые актуальные вопросы нейробиологии, такие как молекулярно-зависимые изменения в форме дендритных шипиков. Структурированная элиминационная микроскопия основана на проецировании линейных узоров на образец, и это дает дополнительную информацию, которую можно извлечь с помощью компьютерной программы, и дает дополнительные четкие изображения, а также позволяет рассмотреть митохондрии ИМ и другие мелкие структуры в клетке. Визуальная демонстрация этого метода важна для того, чтобы добиться достоверной реконструкции изображения SIM-карты, крайне важно пройти через шаги, которые обеспечат вам хорошее качество исходных данных.

Важным подготовительным этапом является нанесение покрытия на покровные стекла, работающие в стерильном ламинарном капюшоне. С помощью небольших стерильных щипцов поместите отдельные покровные стекла в одиночные лунки 12-луночного планшета. Затем добавьте в каждую лунку по 500 микролитров раствора полилизина, чтобы погрузить покровные стекла.

После промывки лунок добавьте один миллилитр гальванической среды и оставьте защитные стекла в инкубаторе для тканевых культур на срок до 24 часов до осаждения клеток. Процедура будет продемонстрирована HU is SH, аспирантом в нашей группе. После выделения эмбриона крысы с помощью тонких щипцов удалите и выбросьте мозжечок из мозга.

Разделите два полушария, сделав сагиттальный разрез по средней линии под препарирующим микроскопом, используйте одну пару небольших щипцов, чтобы аккуратно удерживать средний мозг и удалить средний мозг. С помощью еще одной пары щипцов оставьте нетронутой оставшуюся часть полушария, содержащую кору головного мозга и гиппокамп. Далее аккуратно удалите мозговые оболочки, переориентируйте ткани так, чтобы гиппокамп был обращен вверх.

Гиппокамп можно определить по характерной для него CS-образной структуре. С помощью тонких щипцов рассеките гиппокамп и поместите его в новую 30-миллиметровую посуду, содержащую свежую холодную посуду X-H-B-S-S. После удаления бегемота кампи из всех эмбрионов подсчитайте общее количество бегемота кампи, а затем нарежьте их небольшими кусочками.

Соберите кусочки в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую три миллилитра одного X-H-B-S-S. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости добавьте шесть микролитров трипсина на гиппокамп. После инкубации и промывки фрагментов гиппокампа, как описано в текстовом протоколе, медленно обработайте фрагменты 30 раз отполированной на огне пипеткой, пока все кусочки ткани не будут однородно распределены в отдельные клетки.

Следите за тем, чтобы не было пузырей. Далее добавьте пять миллилитров гальванической среды, предварительно предупрежденной до 37 градусов Цельсия. После подсчета клеток с помощью триана синего витального окрашивания затравки, 50 000 клеток на лунку из 12 лунок в один миллилитр гальванической среды на общий объем два миллилитра.

После покачивания планшета для равномерного распределения клеток, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа. Через два-три дня замените 0,5 миллилитра гальванической среды питательной средой, содержащей 10 микромолярных FUDR. Для трансфекции нейронам добавляется липэктомия.

Смешайте по каплям до смеси ДНК и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. В ламинарном проточном колпаке, за 10 минут до окончания 30-минутной смеси ДНК-липэктомии, инкубации, пипеткой пипетируют кондиционированную среду из исходного или первого культурального планшета во второй 12. Хорошо наложите и храните эту пластину при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в первой культуральной пластине.

Быстро заменил кондиционированную среду на один миллилитр предварительно подогретой инкубационной среды, чтобы предотвратить высыхание клеток. Поместите обе пластины обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа. В конце 30-минутной инкубации ДНК-липэктомии смесь ДНК-липэктомии готова к добавлению в клетки.

Осторожно добавьте по каплям 200 микролитров смеси ДНК-липэктомии в каждую лунку и инкубируйте в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа. После 45-минутной инкубации с помощью небольших щипцов приподнимайте покровные листы, удерживающие нейроны. Промойте их, опустив в трехсантиметровую посуду со свежей, теплой нейробазальной средой, и поместите в лунку.

Во втором 12 лунок находится планшет, содержащий кондиционированную среду. Затем инкубируйте трансфицированные нейроны при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 48 часов. Чтобы подготовиться к иммуноокрашиванию, осторожно отсасывайте среду из лунок, содержащих покровные стекла.

Затем осторожно добавьте 500 микролитров теплого 4% PFA, чтобы не повредить дендриты. После инкубации и промывки клетки блокируют 1%-ным раствором T-B-S-B-S-A при комнатной температуре в течение 30 минут после повторной промывки, добавляют разведенное в инкубации первичное антитело, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Затем выдерживать в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с легким встряхиванием.

На следующее утро удалите первичное антитело и с этого момента снова промойтесь, храните покровные стекла в защищенном от света месте. Далее добавляют вторичное флуоресцентное конъюгированное антитело, разведенное в инкубации. Перемешайте и выдержите при комнатной температуре в течение двух часов.

Затем удалите вторичное антитело и промойте клетки с помощью тонкого пинцета. Снимите защитные стекла с лунок и высушите излишки TBS салфеткой. Наконец, установите покровные листы с помощью монтажного носителя и заклейте лаком для ногтей.

Чтобы начать визуализацию SIM-карты, включите лазер с яркостью 488 нанометров, ртутную лампу, контроллер сцены, контроллер пизо и галогенную лампу для пропускания света. Запустите программное обеспечение SIM-карты в режиме и или для nsim. Нанеся каплю погружного масла на объектив, убедитесь, что в капле масла нет пузырьков воздуха.

Поместите покровную крышку с нейронами гиппокампа на предметный столик микроскопа. Перемещайте объектив вверх до тех пор, пока масло не коснется образца. Не забудьте накрыть предметный столик крышкой во время процедуры забора, чтобы защитить образец от окружающего света и максимально приглушить свет в комнате.

В программном обеспечении SIM выберите оптическую конфигурацию IFI и выберите пустой блок фильтра между одним для визуального осмотра с установкой белого света образца фокусировки. Затем выключите белый свет и включите ртутную лампу. Откройте затвор и выберите зеленый фильтр для поиска достаточно яркого дендрита.

Встретив достаточно яркий дендрит, представляющий интерес, и центрируя интересующий сегмент в поле зрения, закройте затвор. Установите в программном обеспечении оптическую конфигурацию 3D SIM 4 88, а настройки камеры следующим образом. Установите режим считывания в значение em.

Усиление в один мегагерц 16 бит. Установите время экспозиции на 100 миллисекунд. Установите мощность лазера на 5%Установите усиление ЭМ на 200.

Установив скорость фокусировки на сверхтонкую, сфокусируйтесь на интересующем объекте. Быстро отрегулируйте параметры камеры следующим образом. Чтобы получить значение интенсивности в диапазоне от 30, 040 до 5, 000, установите мощность лазера на 0%-20%Установите время экспозиции от 50 миллисекунд до двух секунд.

Установите режим считывания в значение em. Усиление в один мегагерц 16 бит. Установите усиление EM на ноль на 300.

Установите коэффициент усиления преобразования в один x на 5,1 x. Установите формат для прямой трансляции в значение no Benning. Установите формат захвата без Беннинга.

Далее настройте параметры стека трех DZ в панели последовательности ND следующим образом, установите диапазон в два мкм. Установите размер шага на 120 нанометров и щелкните исходное положение. Затем выберите оптическую конфигурацию, 3D SIM 4 88 в разделе лямбда.

После выбора 3D SIM в качестве режима сбора данных запустите сбор данных последовательности ND и сохраните необработанные данные, дендриты и дендритные шипы, полученные с помощью конфокальной и симуляционной микроскопии. Данные были реконструированы по конфокальным и SIM-изображениям. Дендриты были прослежены, а шипы были классифицированы автоматически с помощью программного обеспечения после корректировки основных параметров, таких как длина шеи, диаметр шейки и диаметр головы.

В прямоугольных областях показан один отдельный дендритный шип, полученный с помощью конфокальной и симуляционной микроскопии и реконструированный из соответствующих стеков Z, что показывает различия в разрешении и точности полученных 3D-реконструкций. Согласно исследованию SIM, количественный анализ диаметра головы и шеи с более высоким разрешением показал, что микроскопия sim измеряет значительно меньшие размеры, чем конфокальная микроскопия для тех же дендритных шипиков, что указывает на то, что SIM способна обнаруживать меньшие изменения в морфологии дендритных шипиков. При проведении этой процедуры важно помнить о приобретении необработанных изображений высокого качества для более достоверной последующей реконструкции того же изображения.

Микроскопия структурированного освещения также может быть эффективной для визуализации живых клеток, позволяя исследовать динамику клеток, таких как хела-клетки, нейроны или бактерии кишечной палочки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить, визуализировать и визуализировать стандартные объяснения от первичных нейронов гиппокампа в суперразрешении.