Последовательный В естественных условиях Визуализация остеогенные стволовых / клеток-предшественников во время разрушения Ремонт

Общая цель этой процедуры заключается в последовательном отслеживании и количественной оценке миграционной пролиферации и дифференцировки эндогенных остеогенных стволовых и прогениторных клеток при восстановлении переломов костей. Это достигается путем сначала мечения миксовируса, устойчивости к вирусу гриппа, одного или MX 1 положительных клеток in vivo путем инъекции полицинической полицитоиловой кислоты, а затем элиминирования резидентных MX 1 положительных гемопоэтических клеток путем облучения. На втором этапе облученным мышам систематически вводят клетки костного мозга дикого типа.

Затем микротрещины генерируются в области Cal мыши с помощью игольчатого сверления. Наконец, выполняется последовательная внутрифлаконная визуализация операции по восстановлению микротрещин. В конечном счете, эти прижизненные изображения могут быть использованы для оценки динамики притока остеогенных стволовых и прогениторных клеток и их экспансии в места перелома.

Таким образом, основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет in vivo повторять визуализацию остеогенных стволовых и прогениторных клеток в процессе заживления переломов. Применение этой техники распространялось на терапию заживления переломов и остеопороза. Так как этот метод предлагает новый инструмент для мониторинга эндогенных остеогенных стволовых клеток-предшественников в регенерации и восстановлении кости.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как генерация микрофрактуры с минимальным повреждением тканей и повторная визуализация травмы перелома in vivo без индуцирования тяжелого образования рубца важны для метода и технически сложны. Для мечения MX one положительные клетки in vivo начните с введения 200 микролитров поликислотной полицитиловой кислоты на 20 граммов MX one Cree репортерного мышиного веса внутрибрюшинный один раз в два дня на 10 дней. Затем для устранения резидентных MX одним положительными гемопоэтическими клетками облучают введенных мышей однократной дозой 9,5 гра. Через 24 часа пересадите один раз по 10 шестым клеткам костного мозга дикого типа внутривенно каждой мыши.

Через четыре-шесть недель обезболите мышь путем внутрибрюшинной инъекции 50 микролитров кетамина ксилазина После подтверждения седативного эффекта путем щипки пальца ноги обрежьте пару волосистой части головы мыши, которой пересадили клетки костного мозга, а затем простерилизуйте открытую кожу с помощью тампона с 70% спиртовым тампоном. Нанесите слезоточивый гель, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы, а затем сделайте поперечный разрез длиной менее одного сантиметра поперек кожи головы, начиная от одного уха и заканчивая другим. Далее поверните животное примерно на 60 градусов и продолжайте разрез до тех пор, пока он не достигнет примерно двух-трех миллиметров от носа с помощью щипцов.

Потяните лоскут ткани к бокам животного, чтобы отделить кожу, теперь должны быть четко видны как лобные кости, так и пересечение сагиттального и коронального швов. Промойте открытую поверхность стерильным PBS, а затем аккуратно сотрите остатки волосков ватными палочками. Затем, чтобы создать микротрещины на теленке, держите голову мыши одной рукой и иглу 30 калибра другой.

С помощью кончика иглы 30 калибра аккуратно просверлите микропрокол на одной стороне лобных костей рядом с пересечением сагиттального и коронального швов. Чтобы избежать проникновения в мозг, переключитесь на больший калибр и поверните новую иглу, чтобы расширить отверстие для прокола примерно до 0,5 миллиметра в диаметре. После создания второго прокола на контралатеральной лобной кости непрерывно капайте PBS в каждое место, протирая до тех пор, пока кровотечение не остановится.

Затем, чтобы избежать высыхания, нанесите достаточное количество капли стерильного физиологического раствора на череп, чтобы полностью покрыть область для получения изображений Видаля. Сначала включите полигональный лазерный сканер, чтобы обеспечить одновременный многоканальный захват изображения со скоростью видео 30 кадров в секунду. Далее включается фемтосекундный титановый сапфировый лазер для многофотонной визуализации.

Установите мощность и длину волны на 880 нанометров для визуализации костной кости второй гармоники на 440 нанометрах для возбуждения томатов GFP и TD, включите твердотельные лазеры 491 нанометр и 561 нанометр. А затем включите детекторы с фотоумножителем для каждого сигнала: полосовой фильтр 435 плюс-минус 20 нм для генерации второй гармоники, 528 плюс-минус 19 нм для GFP и 590 плюс-минус 20 нм для TD-томатов. Теперь поместите животное на моторизованный предметный столик для микроскопа с осью XYZ на электрическую грелку, установленную на 37 градусов по Цельсию.

Используйте ленту, чтобы удерживать мышь в нужном положении, а затем нанесите каплю теплого геля на основе метилцеллюлозы на череп. Чтобы избежать высыхания, наденьте на область визуализации покровное стекло. Затем используйте 30-кратный объектив для погружения в воду с числовой апертурой 0,9 и контроллер по оси XY, Z для обнаружения сигнала ГСП от костей.

Чтобы найти поверхность тельной мышцы, определите важнейшее местоположение ориентира, такое как пересечение сагиттальных швов и корональных швов, и получите изображение. Отметьте координаты XY, Z ориентира и далее продолжайте поиск места повреждения, используя ГВГ и флуоресцентные сигналы в качестве ориентиров. Когда каждая область будет найдена, получите изображение наилучшей фокальной плоскости, содержащей ГВГ и флуоресцентные сигналы от интересующих клеток.

Сохраните координаты XY, Z и расстояние до пересечения сагиттального и коронального швов, чтобы определить их точное местоположение для следующего раунда визуализации. Затем собрать 3D клеточные и костные структуры от перелома травмы. Записывайте изображения с интервалом примерно от двух до пяти микрон Z с глубиной около 100 микрон от поверхности эндокостной кости.

Наконец, после визуализации обоих мест повреждения используйте несколько капель стерильного физиологического раствора для удаления 2%-ного геля метилцеллюлозы из черепа. Теперь обмажьте поверхность антибиотиками и накройте череп кожными лоскутами, снова закройте кожу головы гипоаллергенной швойной нитью и держите животное в теплой восстановительной камере до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание. Через три-пять дней повторите шаги визуализации Intravital для отслеживания клеточных изменений во время заживления перелома.

В этом репрезентативном эксперименте на лобных костях генного остеокальцина MX были созданы два микроперелома, мыши GFP после облучения и замены костного мозга последовательная 3D интравитальная визуализация микропереломов показала перемещение остеогенных стволовых и прогениторных клеток томата в пределах места перелома на второй день. а также их расширение на пятый день. Несмотря на то, что в это время не было обнаружено GFP-положительных остеобластов, на 12-й день подгруппа остеопредшественников вблизи поверхности перелома инициировала дифференцировку томатоположительных GFP-положительных остеобластов, как указано стрелкой, накопление новых остеобластов и образование новой кости на 21-й день указывает на то, что миграция и пролиферация остеогенных клеток-предшественников была основным механизмом поставки новых остеобластов для заживления перелома. Чтобы проверить, обеспечивает ли этот метод последовательный и количественный вывод числа остеопредшественников во время заживления переломов, в течение 14 дней после травмы отслеживали остеогенные стволовые и прогениторные клетки MX one YFP.

Небольшое количество предшественников было последовательно обнаружено на месте повреждения в течение трех дней. Количество сотовых телефонов постоянно увеличивалось на седьмой день, достигнув пика на 10-й день, который сохранялся в течение 14 дней. Кинетика генерации остеопредшественников была количественно определена путем измерения интенсивности сигнала YFP с течением времени и коррелировала с той, которая наблюдалась с помощью внутрижизненной микроскопии.

Предшественники впервые наблюдались на третий день, достигли пика на 10-й день и оставались на такой же высокой интенсивности до 14-го дня. При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что квалифицированные методы наложения швов и минимальное кровотечение могут уменьшить образование рубцов и снизить фоновую аутофлуоресценцию. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как визуализировать и отслеживать миграционную пролиферацию и дифференцировку эндогенных остеогенных стволовых клеток-предшественников в процессе восстановления переломов.