Последовательный

Общая цель данной процедуры заключается в последовательном отслеживании и количественной оценке миграции, пролиферации и дифференцировки эндогенных остеогенных стволовых клеток и клеток-предшественников при заживлении переломов костей. Это достигается путем первоначального мечения in vivo клеток, экспрессирующих белок MX1 (резистентных к вирусу гриппа и миксовирусам), с помощью инъекции полииносаина-полицитидина, с последующим уничтожением резидентных MX1-положительных гемопоэтических клеток посредством облучения. На втором этапе облученным мышам систематически вводят клетки костного мозга дикого типа.

Затем с помощью иглы-бура в области Cal у мыши создаются микропереломы. В завершение проводится последовательная прижизненная визуализация процесса заживления микропереломов. В конечном итоге эти прижизненные изображения могут быть использованы для оценки динамики притока и экспансии остеогенных стволовых клеток и клеток-предшественников в области переломов.

Таким образом, основным преимуществом данного метода является возможность многократного прижизненного (in vivo) получения изображений остеогенных стволовых клеток и клеток-предшественников в процессе заживления перелома. Применение этой методики может быть распространено на терапию заживления переломов и лечение остеопороза, поскольку данный метод предоставляет новый инструмент для мониторинга эндогенных остеогенных стволовых клеток-предшественников при регенерации и восстановлении костной ткани.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как создание микроперелома с минимальным повреждением тканей и повторная визуализация повреждения in vivo без возникновения выраженного рубцевания являются важными и технически сложными аспектами метода. Чтобы пометить MX1-положительные клетки in vivo, начните с внутрибрюшинного введения 200 µL полиадениловой-полицитидиловой кислоты на 20 г веса мыши с репортером MX1 раз в два дня в течение 10 дней. Затем, чтобы элиминировать резидентные MX1-положительные гемопоэтические клетки, облучите введенных мышей однократной дозой 9.5 Gy. Через 24 часа проведите внутривенную трансплантацию 1 × 10⁶ клеток костного мозга дикого типа каждой мыши.

Через четыре-шесть недель проведите анестезию мыши путем внутрибрюшинного введения 50 µL кетамина и ксилазина. После подтверждения седации путем щипка за палец, выбрейте шерсть на скальпе мыши, которой были трансплантированы клетки костного мозга, а затем стерилизуйте открытый участок кожи тампоном с 70% спиртом. Нанесите слезозаменительный гель для предотвращения дегидратации роговицы, после чего сделайте поперечный разрез скальпа длиной менее одного сантиметра, начиная от одного уха и заканчивая другим. Затем поверните животное примерно на 60 градусов и с помощью пинцета продолжите разрез до достижения точки в двух-трех миллиметрах от носа.

Отодвиньте лоскут ткани в стороны, чтобы отделить кожу; теперь должны быть четко видны обе лобные кости и место пересечения сагиттального и коронарного швов. Промойте открытую поверхность стерильным PBS, затем осторожно удалите остатки шерсти ватными тампонами. Далее, для создания микропереломов в своде черепа, удержите голову мыши одной рукой, а иглу 30-го калибра — другой.

Используйте иглу 30-го калибра, чтобы аккуратно сделать микропрокол с одной стороны лобных костей вблизи пересечения сагиттального и коронального швов. Чтобы избежать повреждения мозга, перейдите на иглу большего калибра и вращайте ее, чтобы расширить отверстие прокола примерно до 0,5 мм в диаметре. После выполнения второго прокола на контралатеральной лобной кости непрерывно капайте PBS в каждое место, промакивая их до полной остановки кровотечения.

Затем, чтобы предотвратить высыхание, нанесите на череп достаточное количество капли стерильного физиологического раствора, чтобы полностью покрыть область получения изображений Vidal. Сначала включите полигональный лазерный сканер для обеспечения одновременного многоканального сбора изображений с частотой 30 кадров в секунду. Затем включите фемтосекундный титан-сапфировый лазер для многофотонной визуализации.

Установите мощность и длину волны на 880 нм для визуализации костей свода черепа методом генерации второй гармоники на 440 нм для возбуждения GFP и TD tomato, включите твердотельные лазеры с длиной волны 491 нм и 561 нм. Затем включите детекторы на базе фотоэлектронных умножителей для каждого сигнала: полосовой фильтр 435 ± 20 нм для генерации второй гармоники, полосовой фильтр 528 ± 19 нм для GFP и полосовой фильтр 590 ± 20 нм для TD tomato. Теперь поместите животное на моторизованный предметный столик микроскопа с осями XYZ, расположенный на электрической грелке, настроенной на 37 °C.

С помощью ленты зафиксируйте мышь в нужном положении, затем нанесите каплю теплого 2% геля на основе метилцеллюлозы на череп. Чтобы предотвратить высыхание, накройте область визуализации покровным стеклом. Затем используйте иммерсионный объектив 30 x с числовой апертурой 0.9 и контроллер осей XY и Z для обнаружения сигнала SHG от костей.

Для поиска поверхности черепа определите ключевой ориентир, например, место пересечения сагиттальных и коронарных швов, и сделайте снимок. Отметьте координаты X, Y, Z этого ориентира, после чего продолжите поиск места повреждения, ориентируясь по сигналам SHG и флуоресценции. При обнаружении каждой области интереса сделайте снимок в оптимальной фокальной плоскости, содержащей сигналы SHG и флуоресценции от исследуемых клеток.

Сохраните координаты XY, Z и расстояние до места пересечения сагиттального и коронарного швов, чтобы точно определить их местоположение для следующего этапа визуализации. Затем выполните сбор 3D-структур клеток и костной ткани в области перелома. Записывайте изображения с интервалом Z-стека примерно от 2 до 5 микрон и глубиной около 100 микрон от поверхности эндокости.

Наконец, после получения изображений обоих мест повреждения, используйте несколько капель стерильного физиологического раствора, чтобы удалить 2% гель метилцеллюлозы с поверхности черепа. Затем нанесите на поверхность антибиотики и закройте череп кожными лоскутами, повторно зашейте кожу гипоаллергенной шовной нитью и поместите животное в теплую камеру для восстановления до тех пор, пока оно не придет в сознание. Через три-пять дней повторите этапы прижизненной визуализации, чтобы отследить клеточные изменения в процессе заживления перелома.

В данном репрезентативном эксперименте на лобных костях генетически модифицированных мышей MX1-tomato-osteocalcin-GFP были созданы два микроперелома. После облучения и замены костного мозга последовательная 3D-интравитальная визуализация микропереломов показала перемещение tomato-положительных остеогенных стволовых клеток и клеток-предшественников в область перелома на второй день, а также их экспансию на пятый день. Хотя к этому времени GFP-положительных остеобластов обнаружено не было, на 12-й день подмножество остеопрогениторов вблизи поверхности перелома инициировало дифференцировку в tomato-положительные GFP-положительные остеобласты, на что указывает стрелка. Накопление новых остеобластов и формирование новой костной ткани на 21-й день свидетельствуют о том, что миграция и пролиферация остеогенных клеток-предшественников была основным механизмом обеспечения новыми остеобластами для заживления перелома. Чтобы проверить, обеспечивает ли данный метод стабильный и количественный вывод данных о числе остеопрогениторов в процессе заживления перелома, в течение 14 дней после травмы отслеживались MX1-YFP-положительные остеогенные стволовые клетки и клетки-предшественники.

Небольшое количество клеток-предшественников стабильно обнаруживалось в месте повреждения к третьему дню. Число клеток непрерывно росло к седьмому дню, достигая пика популяции к 10-му дню, который сохранялся и на 14-й день. Кинетика генерации остеогенных предшественников была количественно определена путем измерения интенсивности сигнала YFP во времени и соотнесена с данными, полученными с помощью интравитальной микроскопии.

Прогениторы были впервые обнаружены на третий день, их количество достигло пика к 10-му дню и оставалось на similarly высоком уровне до 14-го дня. При выполнении данной процедуры важно помнить, что применение квалифицированных техник наложения швов и минимизация кровотечения позволяют уменьшить образование рубцов и снизить уровень фоновой автофлуоресценции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать и отслеживать миграцию, пролиферацию и дифференцировку эндогенных остеогенных стволовых клеток-предшественников в процессе заживления перелома.