Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как В пробирке Модель инсульта

Общая цель этой процедуры заключается в применении цитотоксической стимуляции к микросрезам мозга для создания модели инсульта in vitro. Это достигается путем предварительного приготовления микросрезов из только что выделенного мозга. Второй шаг - уравновесить микросрезы с помощью легкого перемешивания.

После того, как микросрезы уравновешены, они готовы к проведению разнообразных экспериментальных манипуляций. В конечном счете, результаты показывают, что микросрезы жизнеспособны в течение как минимум двух часов после генерации. Основное преимущество нашей методики по сравнению с другими существующими методами, такими как первичные эмбриональные, нейронные культуры, заключается в том, что наша методика использует срезы зрелой ткани мозга, которые содержат более одного типа клеток и, следовательно, являются более репрезентативными для интактной мозговой ткани.

Первым делом необходимо получить свежую ткань мозга. Опустите мозг в небольшое количество теплого буфера Кребса. Чтобы удалить остатки кожи, шерсти или крови, приготовьте измельчитель клюва с двумя листами фильтровальной бумаги, смоченной теплым буфером Кребса.

Когда все будет готово, поместите мозг на сцену измельчителя. Поддерживайте мозг и фильтровальную бумагу во влажном состоянии с помощью теплого буфера из кребса, одновременно работая над тем, чтобы мозг не скользил. Не допускайте скопления слишком большого количества жидкости на поверхности.

Разрежьте мозг на корональные срезы размером 250 микрометров. Далее поворачиваем предметный столик на 90 градусов и создаем сагиттальные срезы размером 250 микрометров. После этого шага участки мозга называются микросрезами.

Поместите микроломтики на круглое дно двух с 10-15 миллилитрами теплого буфера из блинов. Осторожно взбалтывайте трубку, пока отдельные микроломтики не окажутся взвешенными, а затем дайте им осесть под действием силы тяжести. Аккуратно удалите надосадочную жидкость, которая будет мутной из-за взвешенного клеточного мусора, и добавьте в трубку 10 миллилитров свежего теплого кремового буфера.

Повторите процедуру промывки четыре раза, чтобы удалить большую часть мусора после тщательной промывки. Уравновесьте микросрезы при температуре 37 градусов Цельсия с помощью легкого встряхивания или инверсии и меняйте буфер Кребса каждые 15 минут в течение одного часа. По истечении этого времени добавьте два миллилитра свежего буфера Кребса температурой 37 градусов Цельсия и переложите от 15 до 20 микроломов в пятимиллилитровую трубку из полистирола с плоским дном.

С помощью наконечника для пипетки с очень широким отверстием и гладкими краями равномерно распределите микросрезы по дну пробирки в один слой так, чтобы каждый микросрез находился не далее нескольких миллиметров от насыщенной кислородом атмосферы. После правильной расстановки инкубируйте микросрезы на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить надлежащее насыщение микросрезов кислородом. Постоянно пропускайте карбоген через суспензию микросрезов так, чтобы газовая линия располагалась непосредственно над поверхностью, чтобы избежать механического разрушения микросрезов и прямого контакта с газом для достижения наилучших результатов.

Очень важно, чтобы микроломтики были правильно аэрированы. Важно, чтобы газопровод был расположен на правильном расстоянии от поверхности микросуспензии. Несколько линий могут быть соединены вместе, чтобы обеспечить выполнение нескольких стимулов.

При этом можно использовать самые разные раздражители. В этом примере микросрезы подвергаются стимуляции AMPA. Обрабатывайте микросрезы цитотоксическим стимулом или только буфером Кребса.

Для контроля на стимулированной группе. Удалите инкубационный раствор в разное время после стимуляции и замените его 300 микролитрами ледяного гомогенизационного буфера в желаемый момент времени. После стимуляции гомогенизируйте микросрезы на льду с помощью гомогенизатора со стеклянным тефлоновым пухом, храните однородное вещество при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к дальнейшему анализу.

Частота дыхания показывает, что микросрезы, собранные из переднего мозга курицы, жизнеспособны в течение двух часов после генерации. Высокий уровень A TP и низкий уровень A DP, обнаруженные в микросрезах, также характерны для жизнеспособных клеток. В этом примере было измерено содержание калия в тканях, и было обнаружено, что оно было чуть выше фонового после вскрытия, но при инкубации с буфером Кребса увеличивалось, добавление WABE и EGTA вызывало снижение содержания калия в тканях, демонстрируя, что микросрезы обычно активно перекачивают калий и что его уровни не связаны с калием, захваченным в мертвых тканях или интерстициальных пространствах.

Здесь микросрезы были сгенерированы из стриатума и сенсорной коры самцов крыс и деполяризованы с использованием буфера с высоким содержанием калия. Скорость фосфорилирования клея N два B варьировала между корой и стриатумом, в то время как скорость фосфорилирования клея A One была одинаковой между двумя областями. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за два часа при правильном выполнении.