Опробование протеасомной деградации в бесклеточной системе у растений

Целевые деградации белков представляет собой важный механизм регулирования в отношении функции клеток. Это происходит с помощью консервативной убиквитин-протеасом пути, который придает полиубиквитиновый цепи с белком-мишенью, что тогда служить "теги", как молекулярные для 26S протеасомы. Здесь мы описываем простой и надежный бесклеточный анализ для протеасомной деградации белков.

Общей целью данного эксперимента является анализ стабильности белка в бесклеточной системе. Это достигается за счет инокуляции Oceana Biana разными штаммами агробактерий. Содержит интересующий вас белок, содержащий бинарную конструкцию.

Затем весь белок извлекается из листьев растения. Листья переносят в микропробирки и инкубируют при комнатной температуре в течение более продолжительных периодов времени. Следующие образцы белка растворяют с помощью SDS акриламида, геля, электрофореза и электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану.

Для того, чтобы обнаружить интересующий белок с помощью специфического антитела, получают результаты, которые показывают стабильность белка в присутствии или отсутствии специфического протеасомального ингибитора на основе вестерн-блоттинг-анализа. В данной работе мы описываем простую методологию изучения стабильности субстрата кисты протосомы INE в присутствии или отсутствии одного из основных компонентов пути деградации протеасомы в бесклеточной системе. Таким образом, эти методы могут дать представление о более безопасной протеасомной деградации.

Он также может быть применен к другим системам, таким как изучение роли регулируемой деградации белка в различных клеточных процессах. В этой демонстрации используется NCOA hamana. Растение легко выращивается, очень восприимчиво к агробактериям и имеет крупные листья, которые легко прививаются.

Выращивайте одно растение в течение четырех-шести недель в горшке с промиксом B в условиях контролируемой окружающей среды с длинным днем и относительной влажностью от 40 до 65%. Время от времени удобряйте растение коммерчески доступными продуктами в соответствии с инструкциями производителя. Как только растение вырастет, выберите листья размером 50 миллиметров на 70 миллиметров или больше.

Для посева агробактерий выращивают штамм агробактерий, содержащий бинарную конструкцию, экспрессируя испытуемый белок в течение ночи при 28 градусах Цельсия в среде YEP, дополненный соответствующими антибиотиками после центрифугирования клеток, ресуспендируют до оптической плотности при 600 нанометрах 0,5 в инфильтрационном буфере и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре. Внедрите культуру в сторону листа с помощью одномиллилитрового безыгольного шприца. После инфильтрации выращивайте растение в течение 72 часов при том же световом режиме Перед сбором урожая, за четыре часа до уборки, проведите инфильтрацию привитых агробактериями участков листьев 10 микромолярным ингибитором или мокомольным ингибитором или мокомольным.

Обработайте лист соответствующими растворителями, соберите инокулированные участки листа, обычно от 200 до 400 миллиграммов свежего веса, и измельчите их в мелкий порошок в жидком азоте. Затем приготовьте общий экстракт белка, поместив измельченную ткань в 500 микролитров буфера для разложения. Осветите экстракт двумя последовательными центрифугированием при 12 000-кратном течении силы тяжести в течение пяти минут, чтобы провести реакцию деградации белка.

Перелейте равные объемы экстрактов, обычно 20 микролитров, в микрофуге-пробирки и инкубируйте их при комнатной температуре в течение более продолжительных периодов времени. Как правило, используется нулевое время выборки, а также временные точки 5, 10, 15, 20 и 30 минут. Остановите реакции, вскипятив буфер для образцов геля SDS, прежде чем анализировать их с помощью вестерн-блоттинга.

Определение образцов белка с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS путем предварительного определения концентрации белка по методу Брэдфорда и загрузки от 50 до 80 мкг общего белка на дорожку. Убедитесь, что все образцы загружены одинаково для контроля загрузки. Сравните интенсивность распространенных видов белка, таких как предполагаемые крупные цепи Рубиса, которые мигрируют как основная полоса с относительной электрофоретической подвижностью около 50 килодальтон.

После электропереноса растворенных белков на нитроцеллюлозную мембрану в соответствии со стандартными протоколами заблокируйте мембрану 5%-ным обезжиренным молоком в TBST на один час при комнатной температуре. Далее разведите первичное антиэпитопное антитело в 1%-ном обезжиренном молоке в TBST до концентрации, рекомендованной производителем. Инкубируйте антитело с заблокированной мембраной в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием.

Затем промойте мембрану в 20 миллилитрах TBST в течение 15 минут один раз, а затем два раза по пять минут при комнатной температуре при слабом перемешивании. Далее разведите вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, в 1%-ном обезжиренном молоке в TBST в соответствии с рекомендациями производителя. Инкубируйте вторичное антитело с мембраной в течение одного часа при комнатной температуре с легким перемешиванием после очередного промывания в TBST, визуализируйте интересующие белки с помощью пероксидазы хрена в репрезентативных экспериментах, показывающих дестабилизацию белка, связанного с защитой растений.

Veep один из них с помощью коробочного белка VBFF через SCF-путь продемонстрирован в N. hamana. Западный анализ крови показал, что количество Veep 1 было значительно снижено при совместной экспрессии с VBF, но оставалось относительно стабильным при отсутствии коэкспрессии VBF. Механизм протеасомальной деградации Veep one дестабилизацией с помощью VBF был выведен из его ингибирования протеасомным ингибитором MG 1 32.

Количественная оценка этих результатов показала почти полное ингибирование V one с помощью VBF, которое практически блокировалось MG 1 32. Несколько более высокие уровни V-1 в присутствии MG 1 32, скорее всего, объясняются ингибированием эндогенной активности гомолога VBF. После промывки этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изучать деградацию белка по начальному пути протеасом.

Тот же экспериментальный план может быть использован для любых других организмов и может быть выполнен для ответа на дополнительные вопросы, такие как роль регулируемой деградации белка в различных клеточных процессах.