Выражение, изоляция, и очистка растворимых и нерастворимых Биотинилированные белков для нервной ткани Регенерация

Общая цель этой процедуры заключается в успешном проектировании, экспрессии и выделении рекомбинантных биотинилированных белков, которые могут быть включены в различные приложения, такие как зонды, датчики, доставка лекарств и тканевая инженерия. Это достигается путем сначала трансформации специально разработанной плазмиды в бактериальную линию клеток-хозяев с использованием мелкомасштабных культур, а затем индуцирования экспрессии целевого белка. Далее определяется наличие и растворимость целевого белка для того, чтобы составить надлежащие процедуры очистки.

Затем процедуру масштабируют для получения большего количества целевого белка, который затем выделяется с помощью методов аффинной хроматографии. Наконец, белки очищают, а затем концентрируют для последующего применения и анализа. В конечном счете, страница SDS и результаты FPLC подтверждают, что рекомбинантные белки были успешно выделены и очищены, а белки дополнительно проверяются на функциональность.

Основное преимущество рекомбинантной белковой инженерии заключается в том, что она позволяет нам создавать в больших масштабах или в миллиграммах количество индивидуально разработанных белков в соответствии с нашими точными научными спецификациями. Например, мы можем добавить новые функциональные возможности к частям этих белков, чтобы обеспечить новые свойства. Сегодня мы покажем вам, как можно биотинизировать концы определенных белков, и мы используем это для специфической иммобилизации или привязки этих белков к поверхностям для управления клеточными функциями, такими как рост нейронов или дифференцировка нейронов.

У людей, плохо знакомых с этим методом, не должно возникнуть особых трудностей при следовании процедурам выделения нативного или ненативного белка. Многие шаги одинаковы, но требуют специального буфера, сформулированного для нативных или ненативных условий. Тщательное внимание к деталям в начале.

Стадии трансформации и тестовой экспрессии обеспечат высокий выход белка во время последующего процесса окончательного масштабирования. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что она показывает, как можно получить рекомбинантные белки с помощью простого лабораторного оборудования и расходных материалов. Используя простую периодическую реакцию, э-уравнивание и питательные среды выращиваются в лидерском масштабе, производя 10 миллиграммов белка на основную культуру.

Кроме того, методы хроматографии могут быть использованы и продемонстрированы, чтобы показать, как белки дополнительно очищаются для последующего применения. Согласно текстовому протоколу, засыпать ночную культуру в 1,8 литра стерильной питательной среды с ампициллином и с помощью пастеровой пипетки добавить шесть-восемь капель стерильного антипеногасителя 2 0 4 поместить культуры в водяную баню температурой 37 градусов Цельсия через фильтр 0,2 мкм, пузырьки сжатого воздуха ввести в культуры через аэрационные камни. Когда культура достигает наружного диаметра 600 от 0,7 до 0,8 при одной миллимолярной ИПТГ и индуцирует его в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия или в течение ночи при 18 градусах Цельсия, в зависимости от того, был ли белок обнаружен в растворимой или нерастворимой фракции в испытуемой экспрессии.

Эксперименты по сбору клеток, переложите культуру в литровые центрифуги и раскрутите ее в течение 15 минут при 14 000-кратном весе и четырех градусах Цельсия. Слейте супер натин и с помощью тонкого шпателя зачерпните бактериальную гранулу в две трубки по 50 миллилитров. Снова оболочьте клетки центрифугированием в течение нескольких минут перед хранением при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Выполнять неродной белок. Выделение нерастворимого белка в каждую замороженную гранулу кишечной палочки. Добавьте 20 миллилитров лизиса, промывочного буфера и вихря и встряхните, чтобы снова суспендировать, чтобы удалить любые крупные куски.

После инкубации на мутаторе в течение ночи раствор будет выглядеть как центрифуга для вязкой суспензии. Суспензия в 20, 500 раз сильнее силы тяжести и комнатной температуры в течение 30 минут. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбросьте гранулу для выделения нативного белка.

Резус суспендирует гранулы в буфере для лизиса в конечном объеме 30 миллилитров вместе с ресуспендированными гранулами на льду. Установите ультразвуковую обработку на амплитуду 30% с импульсом 30 секунд на 30 секунд выключенной и продолжайте работать ультразвуком в течение пяти минут. Покачивайте трубку вверх и вниз во время ультразвуковой обработки, чтобы полностью разрушить клеточную гранулу.

Центрифугируйте суспензию при температуре 20, 500 раз сильнее и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Затем переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбросьте гранулы. Чтобы выполнить аффинную хроматографию на неродном изолированном белке, добавьте один миллилитр раствора никелевой смолы NTA в каждую пробирку центрифуги и инкубируйте на мутаторе или шейкере при комнатной температуре в течение не менее одного часа.

Вылейте суспензию в аффинную колонну и дайте раствору полностью стечь через клапан запорного крана в стакан для отходов. Добавьте 10 миллилитров промывочного буфера в пробирку центрифуги, чтобы удалить остатки смолы, и добавьте раствор в колонку после того, как раствор просочится. Используйте стеклянный стержень для перемешивания смолы и дайте ей закончить капать, прежде чем добавлять еще одну промывку.

Далее с помощью 10 миллилитров промывочного буфера повторите полоскание пробирки центрифуги и перенесите ее в колонку. Затем выполните еще восемь промывок колонки с 10 миллилитрами буфера для промывки лизиса для каждой промывки. После завершения промывки закройте стопорный кран и замените стакан для отходов центрифужной трубкой объемом 50 миллилитров.

Добавьте в колонку 15 миллилитров элуцианского буфера, перемешайте смолу и дайте раствору настояться в течение пяти минут. Затем откройте стопорный кран и соберите EIT, прежде чем повторить с добавлением дополнительных 15 миллилитров элюирующего буфера для очистки нативного белка. После добавления никелевой смолы NTA в белковый раствор, инкубируют на мутаторе при четырех градусах Цельсия в течение не менее одного часа.

После использования промывочного буфера для промывки колонки 10 раз, добавьте пять миллилитров элюирующего буфера и инкубируйте смолу в течение пяти минут, прежде чем использовать свежую пробирку для сбора большей части EIT, пока EIT капает из колонки, добавьте 90 микролитров реагента Bradford на лунку в прозрачную 96-луночную пластину. После каждого пятимиллилитрового элуциана с буфером дайте 10 микролитров раствора капнуть из колонки в лунку, содержащую 90 микролитров брэдфордского реактива. Продолжайте использовать ЕАЭС до тех пор, пока белки для диализа и Рены не перестанут обнаруживаться.

Белки переносят каждую ЭИТ в диализную трубку и диализуют в соответствующем буфере, один в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия, прежде чем заменить его соответствующим буфером. Две ночи при четырех градусах тепла. Используйте спиновые концентраторы для концентрации диализованных белков до уровня менее пяти миллилитров и дальнейшей очистки с помощью эксклюзионной хроматографии, если это необходимо.

Согласно текстовому протоколу во время тестового экспрессии, NGF и SE 3 A сначала индуцировались в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия, и анализ страницы SDS определил, что оба белка находятся в этой растворимой фракции. Экспрессия белка казалась удовлетворительной, и поэтому была исследована еще одна тестовая экспрессия с ночной индукцией при 18 градусах Цельсия. Экспрессия NGF улучшилась в растворимой фракции, в то время как с SEMA 3 заметной разницы не наблюдалось.

NGF выделяли в нативных и ненативных условиях и пропускали через колонну FPLC для очистки. Несмотря на то, что во время тестовой экспрессии NGF находился в растворимой фракции, нативная изоляция давала низкий выход при индукции 37 градусов Цельсия и 18 градусов Цельсия. Тем не менее, более высокий выход NGF был получен за счет неродной изоляции с повторной натурацией.

В результате NGF был изолирован в ненативных условиях. После ночной индукции при 18 градусах Цельсия неродная изоляция привела к отсутствию SEMA 3, производству с 8,61 плюс-минус 3,1 миллиграмма на основную культуру из двух литров для естественной изоляции. Таким образом, SEMA 3 A индуцировали в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия и изолировали с использованием нативных параметров изоляции.

Были собраны пики FPLC и проанализированы три образца A NGF и SEMA с помощью страницы SDS. Дополнительные белковые пики, обнаруженные на выходе FPLC для SEMA three A, были собраны и проанализированы с помощью SDS page и не были расположены в области молекулярной массы SEMA three a. Эти фракции, скорее всего, являются продуктами деградации, потому что они не вели себя функционально в клеточных анализах, как это было в SEMA 3.

Здесь указан пик. После создания и освоения рекомбинантного белка выделение и очистка должны занять всего несколько дней, если они выполнены правильно. Тем не менее, начальные стадии трансформации бактерий и тестовые тестовые экспрессии занимают больше времени для правильного определения растворимости белка.

Как только растворимость определена, библиотека трансформированных бактерий может сохраняться при температуре минус 80. Кроме того, после экспрессии белка гранулы кишечной палочки могут храниться при температуре минус 80 до дальнейшего выделения и экспериментов. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что буферы стерилизованы и сделаны свежими, чтобы предотвратить денатурацию протеаз и разрушение белков.

Изоляционные буферы следует изготавливать и стерилизовать каждые четыре-шесть недель, а диализные буферы следует делать за день до изоляции. Колонки N-I-N-T-A и FPLC должны быть чистыми в соответствии с протоколами производителя, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение несколькими биотинилированными белками. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как экспрессировать, выделять и очищать специально разработанные биотинилированные белки с помощью системы экспрессии бактериального хозяина.

Это похоже на то, что делается как в научном, так и в коммерческом плане в малых и больших масштабах. Таким образом, это имеет широкое применение.