Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Общая цель данной процедуры — проведение визуализации и анализа митоза нейральных предшественников в живых срезах мозга мыши. Для этого сначала проводят диссекцию мозга эмбрионов. На втором этапе с помощью вибротома подготавливают срезы мозга.

Далее проводится прижизненная визуализация срезов мозга. Заключительным этапом является извлечение информации из видеозаписей для анализа интересующих параметров митоза. В конечном итоге таймлапс-микроскопия используется для демонстрации того, как популяции клеток-предшественников мозга делятся в режиме реального времени.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как анализ фиксированных образцов, является возможность получить глубокое представление о временной динамике деления нейральных предшественников в живых срезах мозга. Она также может быть использована для изучения того, как генетические пертурбации влияют на деление нейральных предшественников. Хотя мы используем этот метод для изучения развития коры, описанный нами анализ может быть применен к исследованию митоза стволовых клеток в других областях мозга или даже за его пределами.

Эту процедуру продемонстрирует Луи y, postdoctoral fellow из моей лаборатории. Начните процедуру со сбора эмбрионов мыши и выделения эмбрионального мозга, включая задний мозг и четыре части мозга с двумя полушариями большого мозга. В емкости со льдом сделайте отверстие для форм для заливки.

Затем налейте 3% среду aros в пластиковую форму и поместите эту форму в отверстие в льду. Перемешивайте среду aros кончиком цифрового термометра до тех пор, пока температура не достигнет 35 °C. Затем быстро перенесите мозг в заключающую среду, чтобы удалить избыток HBSS на границе раздела между мозгом и средой aros.

Осторожно и плавно неоднократно вращайте мозг в встраивающем растворе. С помощью пинцета создайте подушку из застывшего агароза на дне формы в месте контакта со льдом. Когда при перемещении мозга кончиком пинцета будет ощущаться эта подушка, расположите мозг дорсальной стороной вверх; мозг не должен опускаться на самое дно формы.

Дайте арос застыть в льду в течение как минимум пяти минут, прежде чем срезать углы формы лезвием бритвы. Аккуратно вырежьте блок арос вокруг мозга, стараясь свести к минимуму количество разрезов, чтобы избежать смещения эмбеддированного мозга. С помощью вибpотома VT 1000 s изготовьте срезы толщиной от 200 до 250 микрон.

Теперь разведите cyto 11 до конечной концентрации от 0,5 до 1 µM в среде для культуры срезов, дополненной факторами роста. В 12-луночную планшетку поместите срезы одного мозга, инкубируя их в 2,5 мл окрашивающего раствора в каждой лунке в течение одного часа при 37 °C. Затем промойте срезы в 2,5 мл среды для культуры срезов без окрашивающего раствора в течение 20 минут. Для монтажа срезов мозга поместите каплю раствора коллагена на дно микролуночного стеклянного блюдца диаметром 35 мм.

Распределите раствор наконечником пипетки так, чтобы он соответствовал размеру среза. Затем перенесите срез в каплю коллагена. Инкубируйте срезы при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего перенесите их в инкубатор с температурой 37 °C и содержанием 5% carbon dioxide.

После 20 минут добавьте в микропланшет с glass-bottom дном в общей сложности 1,2 миллилитра среды для культивирования срезов, при этом вливайте среду порциями по 600 микролитров и распределяйте её кончиком пипетки. Оставьте срезы для восстановления в инкубаторе минимум на 1 час 30 минут при 37 °C и 5% carbon dioxide перед их переносом в инкубационную камеру спиннинг-дискового конфокального микроскопа при тех же условиях. Для прижизненной визуализации используйте силиконовый иммерсионный объектив 60x с рабочим расстоянием 300 микрон и числовой апертурой 1,3.

Для визуализации клеток выполните Z-стек толщиной 30 микрон, центр которого должен находиться примерно на 40 микрон ниже поверхности среза. При необходимости отрегулируйте мощность лазера и время экспозиции, чтобы ограничить фотовыгорание; используйте время экспозиции в диапазоне от 30 до 200 миллисекунд в зависимости от интенсивности сигнала cyto 11. Ниже представлены репрезентативные данные, которые можно получить в результате этого анализа для идентификации фигур митоза в ImageJ. После открытия набора данных для одной позиции в виде гиперстека выберите один Z-срез, на котором ткань и клетки выглядят здоровыми.

Прокрутите запись назад, чтобы определить момент времени, когда клетка вступает в митоз. Клетка может перемещаться между Z-плоскостями, однако временное разрешение и параметры Zack, описанные ранее, были оптимизированы для обеспечения этого процесса. В электронной таблице запишите четыре D-координаты клетки в гиперстеке в момент вступления в митоз.

Знание этих координат позволит избежать многократного подсчета одной и той же клетки. Перемотайте запись вперед и зафиксируйте время перехода клетки из одной фазы в другую. Задокументируйте продолжительность каждой фазы митоза для данной клетки, чтобы провести 3D-реконструкцию клеток и количественную оценку вращения во время метафазы.

После идентификации нескольких клеток в состоянии митоза используйте координаты одной из клеток и прокрутите временную шкалу вперед до самого начала. В метафазе поверните весь гиперстек так, чтобы граница желудочка стала плоской. Используйте инструмент измерения угла, чтобы определить угол поворота.

Определите плоскость Z, в которой исследуемая клетка видна наиболее отчетливо. С помощью инструмента «прямоугольное выделение» выделите область, охватывающую всю клетку. Затем определите диапазон плоскостей Z, в которые входит исследуемая клетка, и с помощью команды дублирования изображения создайте подстек.

В диалоговом окне оставьте отмеженным пункт «duplicate hyper stack» для срезов. Параметр Z соответствует Z-плоскостям, охватывающим всю клетку, а параметр T — текущему моменту времени. После этого создайте 3D-реконструкцию клетки.

На текущий момент времени. Межсрезовое расстояние соответствует интервалу между изображениями плоскости Z в микронах. С помощью полосы прокрутки поверните полученную 3D-реконструкцию так, чтобы стал виден край метафазной пластинки.

Номер кадра соответствует бета-углу. Запишите это число. Затем измерьте угол между горизонталью и выравнивающими стержнями.

Рассечение метафазной пластинки перпендикулярно. Это запись угла альфа. Данные углы определены для всех временных точек метафазы исследуемой клетки.

Угол поворота между временными точками t и t минус один равен абсолютному значению разности между углом в момент t и этим углом в момент T минус один вдоль дорсо-вентральной оси. Митоз легче всего визуализировать в дорсальных областях срезов мозга, так как базальный отросток RG-клеток короче и, следовательно, с меньшей вероятностью будет перерезаться при микротомии. Вдоль ростро-каудальной оси срезы в каудальных областях дорсальной коры дают наиболее стабильные результаты.

На данных изображениях представлены примеры подходящей и неподходящей областей для визуализации. В подходящей области ядра имеют эллиптическую форму, и перед началом таймлапс-съемки на границе желудочка наблюдается множество митотических клеток; в неподходящей области на границе желудочка наблюдается очень мало митотических клеток, а ядра имеют округлую форму.

Здесь представлен пример качественного среза, исследованного с помощью микроскопа с малым увеличением перед прижизненной визуализацией, а также несколько примеров клеток, меченных cyto 11, на разных фазах митоза. На данном изображении показан монтаж области на границе желудочка, где два нейральных предшественника проходят через различные фазы митоза, отмеченные разными цветами, после выполнения данной процедуры. Для поиска ответов на дополнительные вопросы, включая определение судьбы делящихся клеток и особенностей поведения цитоскелета, могут быть применены другие методы, такие как нейральная электропорация ДНК-конструкций.

Также для отслеживания митоза рекомендуется использовать дополнительные методы, помимо CY 11, например, трансгенных мышей H2V-GFP. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как манипулировать срезами мозга, какие параметры сопоставления являются оптимальными и как анализировать полученные данные.