Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

В следующем протоколе будет продемонстрировано измерение биоэнергетических профилей и ответов на окислительные взрывы моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов крови человека. Это достигается путем сбора сначала охристой шерсти и богатых тромбоцитами фракций плазмы из свежеполученной крови. На втором этапе популяция гетерогенных лейкоцитов разделяется на мононуклеарные и полиморфноядерные клеточные слои по градиенту плотности.

Затем популяции чистых моноцитов нейтрофилов и лимфоцитов дополнительно изолируют путем максимального разделения, а затем покрывают их для анализа внеклеточного потока или XF. В конечном счете, чувствительное и воспроизводимое измерение митохондриальной функции в моноцитах, лимфоцитах и тромбоцитах, а также окислительного взрыва скорости потребления кислорода моноцитами и нейтрофилами может быть измерено с помощью технологии XF. Преимущество метода, который мы покажем вам сегодня, заключается в том, что вы можете получить из небольшого образца крови все основные клетки, которые находятся в крови пациента.

Это тромбоциты и лейкоциты в чистом инактивированном виде и измеряют их митохондриальную функцию. Это, как мы думаем, может отражать различные заболевания и состояния внутри пациента в режиме реального времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся метаболизма, например, какова роль образа жизни, диеты и патологического стресса в функции митохондрий.

Этот протокол сочетает в себе несколько технологий для выделения и определения клеточной биоэнергетики в различных популяциях лейкоцитов и в тромбоцитах. Этот этап протокола очень важен, поскольку градиент плотности и магнитное разделение требуют точного пипетирования. Кроме того, вы должны знать, где находятся клеточные популяции во время фракционирования.

Мы продемонстрируем выделение клеток периферической крови и анализ клеточной биоэнергетики на 24-луночном анализаторе внеклеточного потока или XF 24. Тем не менее, этот метод также может быть выполнен на XF 96, по крайней мере, за два часа до начала процедуры. Увлажните щупы картриджа датчика XF раствором XF cran.

Затем раскрутите свежеполученную цельную кровь в течение 15 минут при температуре 500 G и комнатной температуре в центрифуге с качающимся ротором ведра. С помощью трансферной пипетки удалите верхний слой, содержащий обогащенную тромбоцитами плазму, до тех пор, пока один сантиметр плазмы не останется над слоем охристого покрытия эритроцитов, и отложите плазму при комнатной температуре для последующей обработки. Затем переложите пальто Баффи в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров и разбавьте лейкоциты до 24 миллилитров.

С базальным РПМИ далее прибавляем три миллилитра низкой плотности, его непрозрачные 1,077 к каждой из трех 15-миллилитровых конических пробирок. Затем поместите кончик узкой пипетки объемом пять миллилитров на дно каждой пробирки. В свою очередь и медленно выделяют три миллилитра высокой плотности, его непрозрачные 1,119.

Теперь используйте автоматическую пипетку на низком энергопотреблении, чтобы осторожно добавить восемь миллилитров разбавленной крови в каждый градиент, не нарушая слои. В градиент низкой плотности добавлен синий краситель для визуализации всех слоев градиента. После раздельного разделения клеток центрифугированием соберите мононуклеарные и полиморфноядерные клетки с помощью стерильных стеклянных пипеток, не нарушая другие полосы клеток.

Объедините мононуклеарные и полиморфноядерные клеточные популяции из каждой пробирки в одну стерильную 50-миллилитровую коническую пробирку для каждого типа клеток и добавьте четыре объема RPMI в обе пробирки. После раскручивания ячеек гранулы переносят в пробирку объемом 1,5 миллилитра и ресуспендируют в 80 микролитрах свежего RPMI с добавлением BSA. Затем добавьте 20 микролитров магнитных шариков, меченных антителами против CD 14 и анти CD 15, к мононуклеарной и полиморфноядерной клеточным фракциям соответственно.

Инкубируйте каждую клеточную суспензию в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, а затем промойте каждую пробирку одним миллилитром среды R-P-M-I-B-S-A ресуспендируйте гранулы в 500 микролитрах R-P-M-I-B-S-A. Затем нанесите клеточные суспензии на отдельные промытые колонки R-P-M-I-B-S-A LS и промойте каждую колонку три раза тремя миллилитрами среды R-P-M-I-B-S-A. Соберите проточные потоки клеточной суспензии и промывки колонок в стерильные пробирки для выделения моноцитов и нейтрофилов, удалите колонки из магнитного поля после окончательной промывки и вымывайте положительно отобранные клетки в стерильную пробирку с пятью миллилитрами R-P-M-I-B-S-A. Чтобы изолировать лимфоциты, гранулируйте проточную промывочную фракцию клеточного столба, ресуспендируйте клеточную гранулу в 80 микролитрах R-P-M-I-B-S-A и инкубируйте клетки в 20 микролитрах антител CD 61 и CD 2 35 A в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем повторите максимальное разделение, как и раньше, и соберите поток, содержащий лимфоциты, чтобы изолировать тромбоциты, центрифугировать, зарезервированную плазму, богатую тромбоцитами, а затем удалить плазму и промыть клеточную гранулу один раз пятью миллилитрами стерильного PBS с добавлением одного микрограмма на миллилитр простагландина I два ресуспендировали тромбоцитарную гранулу в одном миллилитре свежего простагландина PBS I двух буферов для пластинчатого покрытия выделенных моноцитов. лимфоциты, нейтрофилы и тромбоциты. Сначала подсчитайте клетки и доведите их до соответствующего объема в среде для анализа XF, чтобы обеспечить плотность затравки от 2,5 до 10 до пятой части клеток на лунку в объеме 200 микролитров. В 24 лунки XF микропланшет для клеточной культуры покрыт клеткой Т для затравки тромбоцитов 2,5 раза по 10 до семи клеток на лунку в объеме 200 мкл.

После вращения клеток на планшете доведите объемы конечной лунки до 660 микролитров с помощью среды XF и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут до проведения анализа XF во время инкубационной нагрузки, 75 микролитров реагентов анализа в указанном порядке в порты для впрыска картриджа датчика XF. Если необходимо получить измерения окислительного взрыва, PMA может быть введен после введения антимицина, после загрузки порта инъекции картридж помещается на анализатор внеклеточного потока, чтобы начать анализ. Биоэнергетические профили лейкоцитов и тромбоцитов могут быть определены с помощью анализатора внеклеточного потока Seahorse XF, который измеряет потребление кислорода клетками в режиме реального времени неинвазивным способом.

Каждый тип клеток нанесен на микропланшет XF 24 с пятью репликациями, как показано на таблице. Репрезентативные базальные и окислительные значения взрыва, измеренные в ходе анализа, и средние концентрации белка на лунку демонстрируются по типу клеток. Значения нормы потребления кислорода нормируются до общего содержания белка в соответствующих лунках и выражаются в виде р молей в минуту на микрограмм белка. Затем по первым трем измерениям устанавливается базальная норма потребления кислорода.

Олигомицин, ингибитор митохондриальной А-ТП-синтазы, вводится в среду XF для оценки скорости потребления кислорода в сочетании с синтезом ТП и представлен в виде ТП, связанного с остаточным потреблением кислорода за вычетом скорости потребления кислорода немитохондриальными формами, что может быть связано с утечкой протонов. Добавление развязывающего FCCP позволяет определить максимальную скорость потребления кислорода с последующим введением антимицина А и ингибитора митохондриального дыхания для измерения немитохондриальных источников потребления кислорода. Резервная емкость является мерой объема дополнительной работы, которую митохондрии могут выполнять при повышенном спросе на энергию, и может быть рассчитана как разница между максимальной скоростью дыхания и базальной для определения окислительной взрывной способности моноцитов и нейтрофилов.

Вводится агонист P-M-A-A-P-K-C, и увеличение скорости потребления кислорода связано с выработкой окислителя оксидазой N-A-D-P-H. После освоения этой техники ее можно выполнить уже через три часа после забора крови, не считая самого анализа, если он выполнен правильно. При выполнении этой процедуры важно поддерживать стерильные условия, выполняя каждый шаг в шкафу биологической безопасности и используя стерильные буферы и среды комнатной температуры. Следуя этой процедуре, мы можем выполнять другие протоколы, такие как факсимильный анализ, для определения чистоты клеток, состояния активации лейкоцитов, а также для определения клеточной биоэнергетики в субпопуляциях лейкоцитов.

После просмотра этого видео у вас теперь должно быть довольно четкое представление о том, как подготовить тромбоциты, лимфоциты, моноциты и нейтрофилы, поместить их в морской конек и измерить окислительный взрыв и функцию митохондрий по этим данным. Затем вы можете проанализировать популяции пациентов и определить, как меняется их биоэнергетика в режиме реального времени. Не забывайте, что работа с образцами пациентов может быть чрезвычайно опасной.

Поэтому во время этой процедуры нужно надеть средства индивидуальной защиты, а также использовать шкаф биологической безопасности.