Продольная Измерение внеклеточного матрикса жесткости в 3D Опухолевые модели с помощью частиц отслеживания микрореология

Общая цель данной процедуры заключается в измерении продольных изменений механических свойств внеклеточного матрикса в трехмерных моделях рака. Это достигается путем первоначального сбора раковых клеток и выращивания опухолевого сфероида подходящим методом до достижения им желаемого размера. Вторым шагом является помещение опухолевого сфероида в коллаген или другой подходящий внеклеточный матрикс.

Затем создается сетка точек отбора проб, и в каждой точке производится видеосъемка. Заключительным этапом является анализ видеоданных, расчет и совмещение реальных логических свойств в каждой пространственной точке. В конечном итоге данный протокол использует анализ траекторий зондирующих микрочастиц для неразрушающего продольного количественного определения пространственных изменений механики внеклеточного матрикса.

Основная идея заключается в том, что объединение методов визуализации внеклеточного матрикса с помощью рентгенологических исследований и трехмерных моделей опухолей in vitro, восстанавливающих взаимодействия внеклеточного матрикса, позволяет получить количественные данные о временных изменениях механической микросреды, которые сопровождают рост опухоли, процессы инвазии и ответ на лечение. Метод, представленный в данном видео, основан на подходе с использованием наложения Agarose для создания неадгезивных 3D-органоидов из установленной клеточной линии рака поджелудочной железы Pan-1. Для начала смешайте 10 ml воды степени чистоты для культивирования клеток с 0,1 g агарозы для получения 1% раствора агарозы.

Нагрейте раствор aros до температуры выше 70 °C перед использованием. Добавьте по 40 µL раствора в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубируйте планшет при 37 °C в течение одного часа; затем соберите раковые клетки с помощью трипсина и приготовьте суспензию из отдельных клеток, после чего разведите суспензию до концентрации 1000 клеток/мл. Добавьте 100 µL этого разведения в лунку, содержащую отвержденный слой aros.

После инкубации поместите образец на шейкер в инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2, на ночь. Снимите образец с шейкера, добавьте 100 µL среды для культивирования клеток и инкубируйте полученный сфероид до достижения желаемого диаметра. Например, через девять дней диаметр одного сфероида составит приблизительно 450 µm.

Для начала подготовьте рабочее место в ламинарном шкафу, используя два флакона объемом по 2 мл. В первый флакон поместите опухолевый стероид, а второй будет служить бесклеточным контролем. Приготовьте разбавленную смесь флуоресцентных трассерных зондов диаметром 1 мкм, модифицированных карбоксилатом, смешав исходные зонды со стерильной водой в соотношении 2:25.

Извлеките из холодильника флакон с бычьим коллагеном в концентрации 3.1 mg/mL и поместите его на лед. В первый пробирочный флакон внесите аликвоту 125 µL коллагена, затем 50 µL раствора разведенного меченого зонда; кратковременно перемешайте на вортексе для распределения зондов. Затем добавьте 235 µL подходящей среды для культивирования клеток, содержащей феноловый красный, до общего объема 410 µL и кратковременно перемешайте на вортексе, после чего перенесите 205 µL во второй флакон. Затем добавьте во флакон приблизительно 2 µL 1 M гидроксида натрия.

После доведения раствора до нейтрального pH кратковременно перемешайте его на вортексе. Затем немедленно верните пробирку в штатив со льдом, чтобы смесь не начала полимеризоваться. Осторожно извлеките 40 µL среды из лунки, содержащей опухолевый стероид.

Сохраните эти 40 µL до выполнения следующего этапа. Проверьте лунку, чтобы убедиться, что стероид был удален на предыдущем этапе. Если нет, перенесите 40 µL обратно в лунку и повторите предыдущий этап.

Если это так, добавьте 40 µL раствора, содержащего стероид, в пробирку. Осторожно перемешайте содержимое первой пробирки, затем перенесите смесь порциями по 60 µL в три отдельные лунки планшета на 96 лунок. После добавления смеси осмотрите каждую лунку под микроскопом, чтобы определить, в какой из них находится стероид. Затем добавьте приблизительно 2 µL 1 M раствора гидроксида натрия и 40 µL среды для культивирования клеток во вторую пробирку и перемешайте на вортексе перед аликвотированием.

Перенесите 60 µL этой смеси в пустую лунку 96-луночного планшета и пометьте её как бесклеточный контроль. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C минимум на один час для формирования сетки точек образцов. Затем перенесите планшет с образцами из инкубатора на предметный столик микроскопа.

Если предметный столик с подогревом недоступен, подождите 10 минут, чтобы образец уравновесился по температуре с комнатной. Осмотрите образец с помощью объективов с малой кратностью увеличения, чтобы убедиться в его целостности и готовности к визуализации. Определите положение опухоли в лунке и зафиксируйте его, сделав снимок в проходящем свете для последующей пространственной совмещенной регистрации.

Как правило, для получения достаточно детальных результатов в каждой лунке выбирают 20 точек пробоотбора, распределенных концентрическими кольцами вокруг сфероида S. Переместите предметный столик в каждую из необходимых позиций и с помощью программного обеспечения микроскопа зафиксируйте координаты XNY. Переключите микроскоп на объектив с большим увеличением и выберите соответствующий фильтр-куб для длины волны возбуждения трассирующих зондов.

Используя список созданных точек, перейдите к первой точке сетки. Отрегулируйте фокусировку, чтобы найти дно лунки, прежде чем перемещаться вверх. Найдите поле зрения, содержащее несколько сфокусированных трассерных зондов.

Проанализируйте гистограмму интенсивности и отрегулируйте интенсивность и время экспозиции таким образом, чтобы обеспечить максимально возможный динамический диапазон, избегая при этом насыщения изображения. Запишите видеопоследовательность с частотой кадров от 20 до 30 мс на кадр и сохраните файл, используя соответствующее соглашение об именовании. Во время записи не прикасайтесь к микроскопу или столу.

Повторите запись для каждой точки выборки в сетке. Затем повторите этот процесс для построения сетки в каждой лунке эксперимента и повторите всю процедуру для каждого временного интервала в ходе лонгитюдного мониторинга.

Для начала анализа данных скопируйте все видеоданные в папку для анализа. Импортируйте данные изображений в MATLAB или другое программное обеспечение для анализа.

Откалибруйте программное обеспечение, проанализировав несколько кадров видео, чтобы надлежащим образом определить параметры выбора и отсева для идентификации центральных позиций зондов. Затем используйте программное обеспечение для автоматического определения положения каждого зонда на всех видеокадрах с последующим объединением этих позиций в траектории. Используйте данные о траекториях для вычисления среднеквадратичного смещения (MSD) как функции времени задержки, обязательно применив соответствующий коэффициент пространственной калибровки для конкретного объектива или любого биннинга пикселей.

Рассчитайте G Star, используя обобщенное уравнение Стокса-Эйнштейна, учитывая пределы применимости данного уравнения для конкретного образца. Повторите этапы анализа для каждого поля зрения в эксперименте. Выполните совмещение данных о положении с модулем вязкоупругости I на определенной интересующей частоте, в зависимости от производителя используемого микроскопа.

Этот этап может быть облегчен с помощью специального алгоритма, который считывает метаданные микроскопа, либо данные о положении могут быть tabulated вручную. Видеопоследовательности регистрируются в нескольких пространственных позициях внутри репрезентативной лунки, содержащей 3D-опухолевый узел, и объединяются для создания пространственной микрорадиологической карты образца при лонгитюдном мониторинге популяций клеток на периферии. Одна из линий клеток, использованная в данном примере, будет спонтанно разрушать окружающие коллагеновые волокна и инвазировать в экстрацеллюлярный матрикс в течение нескольких дней.

В данном примере совместная регистрация микроскопии и реологии обеспечивает количественную оценку явной инвазии в матрикс, происходящей слева, но не справа от стероида. Лонгитюдный мониторинг этих различных пространственных областей показывает снижение действительной составляющей комплексного модуля сдвига вязкоупругости примерно на четыре порядка, сопутствующее инвазии. Полные частотно-зависимые данные демонстрируют различие реологических свойств материала в области один и области два на четвертый день.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости избегать типичных ошибок при анализе траекторий зондов, которые могут привести к неверным выводам. Мы рекомендуем читателям обратиться к цитированной здесь литературе по PTM, в которой рассматриваются такие аспекты, как дрейф образца и интерпретация гетерогенности. Данную процедуру можно сочетать с дополнительной лонгитюдной или терминальной флуоресцентной визуализацией для решения других задач, например, для изучения корреляции между механическим ремоделированием и ключевыми событиями сигналинга или цитотоксическим ответом на воздействие.