Использование каспазы мультиплексирования Пробирной для определения апоптоза в гипоталамуса Cell Model

Общая цель этого видео — продемонстрировать высокопроизводительный мультиплексный анализ для определения начала апоптоза, измеряемого с помощью каспазы. Три семь. Сначала нейроны гипоталамуса подвергаются воздействию апоптотической насыщенной жирной кислоты, пальмитиновой кислоты.

Затем измеряется клеточная жизнеспособность нейронов с помощью флуоресцентного реагента и считывателя микропланшетов после начала апоптоза. К клеткам добавляется субстрат люмино, DEVD, представляющий собой аминокислотную последовательность, расщепленную каспазой 3. Заключительным этапом процедуры является измерение люминесценции с помощью считывателя микропланшетов для определения активности каспаз, которая увеличивается в клетках, подвергающихся апоптозу.

В конечном счете, соотношение активности каспазы на жизнеспособные клетки может быть получено менее чем за пять-шесть часов. В формате 96 лунок. Основное преимущество этой методики по сравнению с нашими существующими методами, такими как вестерн-блоттинг или лизис, заключается в том, что это быстрый, недорогой анализ, который позволяет напрямую измерить активность каспазы три семь в нескольких луночных форматах.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в этой области, такие как определение первичных модуляторов апоптоза. Полезность данного метода заключается в том, что такое мультиплексирование может быть использовано в качестве точного метода оценки цитотоксичности и жизнеспособности. Несмотря на то, что анализ довольно прост, визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку она гарантирует, что анализ будет успешно завершен.

Хотя этот метод может дать представление о нейродегенерации, он также может быть применен к другим заболеваниям и моделям in vitro, таким как те, которые используются в исследованиях рака. Людям, не знакомым с этим методом, потребуется оптимизировать эту технику, потому что конечные точки зависят от клеточной линии и агониста. Активность каспазы три-семь преходящая.

Таким образом, в зависимости от эффективности клеточного стрессора, определение подходящего времени для анализа активности основания отливки может потребовать некоторых усилий, чтобы начать быстро. Разморозьте замороженные 12 клеток на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. После размораживания аккуратно переведите клетки в вентилируемую культуральную колбу площадью 75 квадратных сантиметров и добавьте 10 миллилитров теплого delcos, модифицированных eagles, medium или DMEM, инкубируйте колбу в течение ночи в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 24 часа аспирируйте среду и замените ее свежей средой, чтобы продолжить рост клеток до тех пор, пока не будет получено от 70 до 80% Confluence после двух-трех дней роста. Для подсчета клеток сначала подогревают ДМЭМ и один х трипсин, раствор ЭДТА до 37 градусов Цельсия. Отсадите среду из колбы и промойте два раза стерильным фосфатным буферным раствором.

Добавьте 500 микролитров раствора триина перед инкубацией при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут. Отсоедините ячейки от колбы с помощью скребка и суспензируйте ячейки в пяти миллилитрах среды. Пропустите клетки через сетчатое фильтр в чистую 50-миллилитровую пробирку.

Возможно, потребуется пропустить клетки через ситечко более одного раза, но не повторяйте более трех раз после подсчета клеток с помощью гемоцитометра затравки. 6 000 клеток на лунку в 96 лунках с черным или белым дном в конечном объеме 100 мкл среды, Инкубируйте пластину при 5% углекислом газе и 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Перелейте пальмитиновую кислоту в стерильный стеклянный флакон объемом пять миллилитров и растворите в 100% ДМСО.

После разведения исходного раствора пальмитиновой кислоты один к 10 в ДМСО, добавить его в PREWARM DMEM для получения конечной рабочей концентрации 0,1 миллимолярной пальмитиновой кислоты для контрольных сред, добавить такую же концентрацию ДМСО, которая была добавлена в среды, содержащие пальмитиновую кислоту. Удалите среду из каждой лунки и замените ее 50 микролитрами средней плюс-минус тиевой кислоты и инкубируйте пластину при 5% углекислом газе и 37 градусах Цельсия в течение двух часов. Затем добавьте пять микролитров смоляных реагентов и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре после инкубации, загрузите планшет на многомодовый считыватель Microplate и зарегистрируйте флуоресценцию с длиной волны возбуждения 560 нанометров и длиной волны излучения 590 нанометров.

Для измерения чувствительности клеток результаты представлены в виде относительных единиц флуоресценции к одному и тому же планшету. Добавьте 55 микролитров литого реагента DEVD и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов. Опять же, с использованием люминесценции Microplate reader для измерения активности каспазы три, семь результаты представлены в виде относительных единиц люминесценции с люминесценцией, прямо пропорциональной каспазе три, семь для нормализации активности каспазы три, семь к количеству клеток, деление жизнеспособности клеток на активность каспазы три, семь.

Этот протокол описывает результаты мультиплексирования двух отдельных анализов для определения механизмов гибели клеток в результате апоптоза. Активность каспазы была значительно повышена в клетках, подвергавшихся воздействию пальмитиновой кислоты. После двухчасовой инкубации целостность клеточной мембраны заметно изменяется в присутствии пальмитиновой кислоты.

Здесь показан потенциальный путь, по которому пальмитиновая кислота индуцирует апоптоз. Понимание основных механизмов стресса, используемого для индукции апоптоза, помогает определить продолжительность инкубации стрессора. Поскольку ферменты каспазы должны быть активированы перед взаимодействием с субстратом DEVD, этот метод может быть выполнен менее чем за пять-шесть часов, если он выполнен правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить мультиплексный анализ активности каспазы три семь с использованием модели культуры нейрональных клеток гипоталамуса in vitro. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что время инкубации зависит от типа клеток и используемых стрессоров или агонистов. Разработка этой методики позволяет исследователям в области нейробиологии использовать надежную и экономящую время технику для исследований апоптоза. После этой процедуры могут быть проведены дополнительные фармакологические анализы, нацеленные на конкретные белки в процессе апоптоза, чтобы очертить основные механизмы, которые инициируют дегенеративные заболевания.