Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Общая цель этой процедуры заключается в использовании РНК-интерференции для исследования влияния генов-кандидатов на врожденный иммунный ответ. В макрофагах мыши для этого клеточные линии макрофагов мыши инизируют и объединяют с раствором для трансфекции и представляющими интерес SI РНК, затем смесь переносят на 96-луночный ядровый планшет VETE и используют трансфекционную систему Maxa 96 Well для трансфекции миРНК в макрофаги и после инкубации с клеточной культурой. среду, ЛПС или другие активаторы врожденного иммунитета наносят на трансфицированные макрофаги для их стимуляции. Наконец, Eliza проводится для мониторинга выработки цитокинов и оценки влияния лечения миРНК на врожденный иммунный ответ.

Основное преимущество этого метода перед липид-опосредованной трансфекцией заключается в том, что наш анализ надежен и может быть применен ко многим генам в высокопроизводительной профессии. Ключом к этому методу является работа со здоровыми клетками, бережное обращение с ними и эффективная работа в процессе трансфекции. Как мы продемонстрируем, в этом протоколе используется необработанная линия макрофагов мыши 2 64 0,7 0,7, которая культивируется, как описано в сопроводительном документе.

При подготовке к трансфекционной пластине INA клетки достигают 20% плавности и растут в течение одного или двух дней, пока клетки не станут слившимися более чем на 80%. Важно помнить о том, что нужно использовать ячейки, которые находятся между третьим и 10 проходами. После размораживания начните эту процедуру с программирования 96-луночной челночной системы, которая будет использоваться для трансфекции.

Для этого запустите программное обеспечение 96 well shuttle на компьютере, подключенном к шаттлу, из верхнего левого меню файла. Выберите новый файл параметров. Выделите скважины, которые будут трансфицированы, на отображаемой схеме пластины 96 лунок.

Зеленым прямоугольником будут обозначены выбранные скважины. Выберите программу, которая соответствует линии макрофагальных клеток, используемой для исходных 2 64 0,7 клеток. Выберите DS 1 36 нажмите применить.

Обратите внимание, что после выбора программы лунки на схематической пластине будут окрашены. Темно-синими пустыми кругами обозначены скважины, которым не назначена программа и которые не будут подвергнуты удару. Далее приготовьте рабочий раствор нуклеоэффектора, смешав раствор нуклеоэффектора SF линии 96 лунок со всем содержимым прилагаемой пробирки.

Дайте смешанным реагентам сбалансироваться при комнатной температуре. Нагрейте D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25% трипсин в ЭДТА и PBS при 37 градусах Цельсия. Приготовьте экспериментальную контрольную плазмиду S-I-R-N-A-P max GFP или флуоресцентно меченные миРНК путем их размораживания на льду для отделения адгезивных макрофагов от чашек для клеточных культур.

Отсадите среду и дважды промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Затем, после удаления PBS, инкубируйте клетки с одним миллилитром предварительно предупрежденного 0,25% трипсин ЭДТА на пластину до тех пор, пока клетки не начнут отделяться. Это занимает одну-две минуты.

Осторожно постукивайте по планшету и перемещайте раствор во время инкубации, чтобы максимизировать выделение трипсина. После того, как клетки отделятся, добавьте девять миллилитров DMEM плюс FBS, аккуратно перемешайте пипетированием вверх и вниз, а затем соберите клетки путем пипетирования в стерильную пробирку. Подсчитайте количество выделенных макрофагов с помощью цитометра Hema.

Ожидайте примерно 10 миллионов макрофагов на 10-сантиметровую пластину. Вычислите общее количество необходимых макрофагов Каждая лунка на 96 лунках челнока требует 200 000 клеток. Пипеткой наберите рассчитанное количество клеток в центрифужную пробирку.

Вращайте ячейки в течение 10 минут при 150 G при комнатной температуре до стерильной 96-луночной круглой нижней пластины, которая облегчает перемешивание и сводит к минимуму потери реагентов. Добавьте по два микролитра каждой IRNA в каждую лунку, которую нужно перевести. Обратите внимание, что в зависимости от количества миРНК это может быть достигнуто на этапе центрифугирования макрофагов.

Самым сложным аспектом этой процедуры является электропорация, ключи, которые воздействуют на клетки очень мягко и работают очень быстро. Как только клетки окажутся в токсичном растворе для трансфекции, отсадите среду из клеток центрифуги, а затем осторожно повторно суспендируйте их в растворе нуклеоэффектора. SF, содержащий раствор добавки.

Немедленно перенесите клетки в стерильную кормушку с помощью многоканальной пипетки, перенесите 20 микролитров ресуспензионной клеточной смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего миРНК, аккуратно перемешанные пипетированием вверх и вниз. Далее переложите 20 микролитров клеточной смеси INA в 96 луночный нуклео-вете планшет. Очень важно избегать образования пузырьков на этом этапе, так как это может привести к ошибкам во время поражения ядра.

Поместив все экспериментальные образцы в трансфекционную пластину, накройте ее прилагаемой крышкой и очень осторожно постучите по твердой поверхности. Чтобы удалить пузыри, поместите 96-луночный планшет в 96-луночный ядерный эффекторный челнок и в правом нижнем углу экрана программы выберите «Загрузить и запустить». Затем следуйте подсказкам программы, чтобы сохранить результаты во время процесса поражения ядра лунок успешно.

Трансфицированный будет изображен на схеме 96 лунки на экране зеленым кругом со знаком плюс. Красный круг со знаком минус указывает на ошибку, скорее всего, из-за пузырьков или пипетирования неправильного объема реагентов сразу после поражения ядер. С помощью многоканальной пипетки добавьте 80 микролитров подогретого RPMI 1640.

Средний сбоку от каждого. Хорошо дайте среде медленно смешаться с трансфицированными клетками, которые на данном этапе очень нежные. Слишком быстрое добавление среды значительно снизит жизнеспособность.

Поместите планшет на 96 лунок с трансфицированными образцами и RPMI 1640 в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на две или более минут. Очень важно дать клеткам восстановиться перед дальнейшими манипуляциями. После извлечения планшета из инкубатора с помощью многоканальной пипетки осторожно перенесите смесь из каждой лунки в 96-луночный планшет для культивирования тканей.

Затем снова с помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую по 100 микролитров DMEM с FBS. Хорошо инкубировать от 24 до 36 часов, сразу после трансфекции и восстановления провести проточную цитометрию. Для оценки эффективности трансфекции флуоресцентно меченых SI irna более 99% клеток должны быть трансфицированы на следующий день после анализа трансфекции Для эффективности трансфекции плазмиды GFP от 30 до 50% клеток должны экспрессировать GFP После инкубации от 24 до 36 часов приготовьте ЛПС или другие активаторы врожденного иммунитета в свежей среде Разведите ЛПС до конечной концентрации 20 нанограмм на миллилитр в DMEM с FBS.

Затем осторожно отсадите среду из 96-луночного планшета и добавьте в клетки свежую среду, содержащую ЛПС. Поместите планшет в инкубатор для мониторинга реакции на ЛПС или другие стимуляторы врожденного иммунитета в разное время после стимуляции. Пипетируйте надосадочную жидкость из клеток в 96-луночный накопительный планшет для анализа с помощью Элизы.

После удаления надосадочной жидкости для контроля жизнеспособности клеток добавьте 100 микролитров от одного до 100 флуоресцеина диацетата в PBS в каждую лунку, инкубируемую при комнатной температуре в течение от одной до пяти минут. Контролируйте флуоресценцию в клетках с помощью планшетного ридера при расщеплении клеточными эстеразами в живых клетках. Это соединение становится флуоресцентным, чтобы проиллюстрировать полезность этого подхода для мониторинга врожденного иммунного ответа.

МиРНК, нацеленные на известные гены врожденного иммунитета, трансфицировали в необработанную клеточную линию 2 64 0,7 макрофагов. Затем клетки стимулировали с помощью ЛПС и выработку провоспалительных цитокинов. IL six и TNF alpha контролировались Элизой, как показано здесь.

Ингибирование толл-подобного рецептора 4, рецептора для ЛПС, но не для других TLR. При использовании SIR сильно сниженная продукция ЛПС индуцировала IL 6 и TNF альфа. Обратите внимание, что ингибирование IL six с irna снижало продукцию IL 6, но не влияло на продукцию TNF alpha.

Эти данные свидетельствуют о хорошей эффективности и хорошей специфичности миРНК-опосредованного нокдауна кандидатов в регуляторы врожденного иммунитета. Важно помнить, что ключом к хорошей трансфекции и хорошему восстановлению клеток является работа с очень здоровыми клетками, бережное обращение с ними во время процесса трансфекции и восстановления, а также быстрая работа, когда клетки находятся в растворе нуклеоэффектора. После этой процедуры могут быть проведены многие другие анализы, включая QPCR для мониторинга нокдауна гена и многие другие анализы для исследования врожденного иммунного ответа.