Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Общая цель данной процедуры — использование РНК-интерференции для изучения влияния генов-кандидатов на врожденный иммунный ответ. Для этого макрофагальные клеточные линии мыши подвергают трипсинизации и смешивают с раствором для трансфекции и соответствующими siRNA; затем смесь переносят в 96-луночный планшет NucleoVette и используют систему трансфекции Maxa 96 Well для введения siRNA в макрофаги. После инкубации в среде для культивирования клеток на трансфецированные макрофаги воздействуют LPS или другими активаторами врожденного иммунитета для их стимуляции. Наконец, проводят анализ ELISA для мониторинга выработки цитокинов и оценки влияния обработки siRNA на врожденный иммунный ответ.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с липидной трансфекцией является его воспроизводимость, что позволяет применять данный анализ ко многим генам в режиме высокого пропускного потока. Ключом к успеху данного метода является использование здоровых клеток, бережное обращение с ними и эффективность действий в процессе трансфекции. Как будет продемонстрировано далее, в данном протоколе используется линия клеток макрофагов мыши RAW 264.7, культивирование которой проводится согласно описанию в сопроводительном документе.

Для подготовки планшета для трансфекции INA высейте клетки с плотностью 20% и культивируйте их один или два дня, пока плотность клеток не достигнет не более 80%. Важно использовать клетки от 3-го до 10-го пассажа. После размораживания начните выполнение данной процедуры с программирования системы перемещения 96-луночных планшетов, которая будет использоваться для трансфекции.

Для этого запустите программное обеспечение для 96-луночного манипулятора на компьютере, подключенном к прибору, через верхнее левое меню «Файл». Выберите «Новый файл параметров». Отметьте лунки, которые будут подвергнуты трансфекции, на отображаемой схеме 96-луночного планшета.

Зеленым цветом будут выделены выбранные лунки. Выберите программу, соответствующую используемой клеточной линии макрофагов для клеток raw 2 64 0.7. Выберите DS 1 36, затем нажмите apply.

Обратите внимание, что после выбора программы лунки на схеме планшета будут окрашены. Темно-синие пустые кружки обозначают лунки, для которых программа не была назначена и в которых электризация не будет проводиться. Далее приготовьте рабочий раствор нуклеоэффектора, смешав раствор нуклеоэффектора для клеточной линии SF в 96-луночном формате со всем содержимым прилагаемой пробирки с добавкой.

Дайте смешанным реагентам уравновеситься при комнатной температуре. Подогрейте D-M-E-M-R-P-M-I 1640, 0.25%трипсин-ЭДТА и PBS до 37 °C. Подготовьте экспериментальную контрольную плазмиду S-I-R-N-A-P max GFP или флуоресцентно меченные siRNA, разморозив их на льду, чтобы отделить адгезивные макрофаги от чашек для культивирования клеток.

Отоберите среду и дважды промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Затем после удаления PBS инкубируйте клетки с одним миллилитром предварительно подогретого 0,25%трипсина ЭДТА на одну лунку до тех пор, пока клетки не начнут открепляться. Это занимает от одной до двух минут.

Слегка постучите по планшету и перемешивайте раствор во время инкубации для максимальной эффективности трипсинизации. После того как клетки открепятся, осторожно добавьте девять миллилитров смеси DMEM и FBS, аккуратно перемешивая раствор пипетированием, а затем соберите клетки, перенеся их пипеткой в стерильную пробирку. Подсчитайте количество изолированных макрофагов с помощью камеры Горяева.

Ожидаемое количество макрофагов составляет примерно 10 миллионов на чашку диаметром 10 сантиметров. Рассчитайте общее количество необходимых макрофагов, исходя из того, что для каждой лунки 96-луночного планшета-челнока требуется 200 000 клеток. Перенесите рассчитанное количество клеток пипеткой в центрифужную пробирку.

Центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 150 G при комнатной температуре в стерильный 96-луночный планшет с круглым дном, что облегчает перемешивание и сводит к минимуму потерю реагентов. Добавьте по два микролитра каждой IRNA в каждую лунку, предназначенную для трансфекции. Обратите внимание, что в зависимости от количества siRNAs это можно сделать во время этапа центрифугирования макрофагов.

Самым сложным аспектом данной процедуры является электропорация; ключевыми факторами здесь являются крайне бережное обращение с клетками и высокая скорость работы. После помещения клеток в токсичный раствор для трансфекции аспирируйте среду из центрифугированных клеток, затем осторожно ресуспендируйте их в растворе NucleoEffector SF с добавлением supplement solution.

Немедленно перенесите клетки в стерильный желоб с помощью многоканального дозатора, перенося по 20 µL ресуспендированной клеточной смеси в каждую лунку планшета на 96 лунок, содержащую siRNAs, предварительно аккуратно перемешанные путем pipetting up and down. Затем перенесите 20 µL смеси клеток в планшет NucleoVet на 96 лунок. На данном этапе крайне важно избегать образования пузырьков воздуха, так как это может привести к ошибкам в процессе нуклеофекции.

После размещения всех экспериментальных образцов в планшете для трансфекции накройте его прилагаемой крышкой и очень осторожно постучите по нему о твердую поверхность. Чтобы удалить пузырьки воздуха, поместите 96-луночный планшет в шаттл NucleoEffector для 96-луночных планшетов и в правом нижнем углу экрана программы выберите «upload» и «start». Затем следуйте подсказкам программы, чтобы сохранить результаты после успешного завершения процесса нуклеофекции лунок.

Трансфицированные образцы будут отображаться на схеме планшета на 96 лунок на экране в виде зеленого круга со знаком плюс. Красный круг со знаком минус указывает на ошибку, скорее всего, вызванную наличием пузырьков воздуха или дозированием неправильного объема реагентов сразу после нуклеофекции. Используйте многоканальный дозатор, чтобы добавить 80 µL предварительно подогретой среды RPMI 1640.

Добавьте среду сбоку каждой лунки. Позвольте среде медленно смешаться с трансфецированными клетками, которые на данном этапе очень хрупкие. Слишком быстрое добавление среды значительно снизит жизнеспособность клеток.

Поместите 96-луночный планшет с трансфицированными образцами и средой RPMI 1640 в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на две или более минуты. Крайне важно дать клеткам восстановиться перед дальнейшими манипуляциями. После извлечения планшета из инкубатора с помощью многоканального дозатора осторожно перенесите смесь из каждой лунки в 96-луночный планшет для культивирования тканей.

Затем с помощью многоканального дозатора добавьте по 100 µL среды DMEM с FBS в каждую лунку. Инкубируйте в течение 24–36 часов, после чего сразу после трансфекции и восстановления проведите проточную цитометрию. Для оценки эффективности трансфекции флуоресцентно меченной SI irna более 99% клеток должны быть трансфицированы на следующий день после проведения анализа трансфекции. Для эффективности трансфекции плазмиды GFP GFP должны экспрессироваться в 30–50% клеток. После 24–36 часовой инкубации приготовьте LPS или другие активаторы врожденного иммунитета в свежей среде; разведите LPS до конечной концентрации 20 ng/mL в DMEM с FBS.

Затем аккуратно аспирируйте среду из планшета на 96 лунок и добавьте к клеткам свежую среду, содержащую LPS. Поместите планшет в инкубатор для мониторинга ответа на LPS или другие стимуляторы врожденного иммунитета через различные промежутки времени после стимуляции. Перенесите супернатант с клеток в архивный планшет на 96 лунок для последующего анализа методом ELISA.

После удаления супернатанта для мониторинга жизнеспособности клеток добавьте в каждую лунку 100 µL раствора флуоресцеиндиацетата в PBS в разведении 1:100 и инкубируйте при комнатной температуре от одной до пяти минут. Измерьте флуоресценцию клеток с помощью планшетного ридера; в живых клетках соединение расщепляется клеточными эстеразами, приобретая флуоресцентные свойства, что демонстрирует эффективность данного подхода для мониторинга врожденного иммунного ответа.

siRNA, нацеленные на известные гены регуляции врожденного иммунитета, были трансфицированы в линию макрофагов RAW 264.7. Затем клетки стимулировали LPS, а выработку провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α контролировали с помощью метода ELISA, как показано здесь.

Ингибирование toll-подобного рецептора 4, рецептора для LPS, но не других TLR. При использовании SIR наблюдалось значительное снижение продукции индуцированных LPS IL six и TNF alpha. Обратите внимание, что ингибирование IL six с помощью irna снижало продукцию IL six, но не влияло на продукцию TNF alpha.

Эти данные свидетельствуют о высокой эффективности и специфичности siRNA-опосредованного нокдауна потенциальных регуляторов врожденного иммунитета. Важно помнить, что залогом успешной трансфекции и хорошего восстановления клеток является использование жизнеспособных клеток, бережное обращение с ними в процессе трансфекции и восстановления, а также быстрота действий после помещения клеток в раствор нуклеоэффектора. После выполнения данной процедуры можно провести множество других анализов, включая QPCR для мониторинга нокдауна генов и другие исследования для изучения врожденного иммунного ответа.