Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 'Конец расщепление пре-мРНК подложках В пробирке

Общая цель этой процедуры заключается в успешном исследовании расщепления трех основных мРНК in vitro. Это достигается путем получения сначала транскрипционно активного ядерного экстракта из клеток, выращенных в суспензии. Вторым этапом процедуры является создание радиометеных субстратов РНК с помощью транскрипции in vitro.

Третий шаг заключается в очистке гелем помеченных РНК-субстратов. Заключительным этапом является сборка реакции расщепления, включающей ядерный экстракт и субстрат меченой РНК. В конечном счете, результаты могут показать три основные мРНК, расщепленные субстраты UNC и расщепленный продукт с помощью вертикального электрофореза радиоактивным гелем.

Визуальная демонстрация этого метода важна, несмотря на то, что он выполняется с 1980-х годов, его нелегко выполнить, так как на протяжении всей процедуры есть много специфических этапов, которые являются сложными. Имеют промытые ячейки, гранулированные и готовые к лизингу. Чтобы начать этот протокол с клеточной гранулы, добавьте буфер со свежим DTT.

Добавьте пять объемов расчетного CPV и с помощью пипетки разбейте гранулу и дайте суспензии остыть на льду. Через 10 минут раскрутите ячейки при температуре четыре градуса Цельсия в качающемся ведре. Центрифугой осторожно отсасывайте надосадочную жидкость.

Гранула впитает в себя некоторое количество раствора и увеличится в размерах. Затем добавьте одну CPV буфера А и аккуратно разбейте гранулу наконечником пипетки. Вылейте суспензию в охлажденный гомогенизатор и пятью-12 ударами плотного пестика проведите по клеткам.

Снимите небольшую аликвоту, нанесите триановый синий и проверьте клетки, чтобы определить полноту их лизиса. При необходимости продолжайте гомогенизацию клеток до тех пор, пока они не будут лизированы на 90%, но не переусердствуйте. Теперь переложите лизат в ультрапрозрачную ультрацентрифужную пробирку.

Запишите общий объем и вращайте его, как это было сделано ранее. Отсадите мутную надосадочную жидкость и сохраните ее на льду. А при анализе цитозоля будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу.

Он содержит ядра. Далее раскрутите дробину на высокой скорости в течение 15 минут. Удалите небольшой объем оставшейся надосадочной жидкости и объедините его с коллекцией цитозоля.

Затем определите ядерный объем PACT. Добавьте в гранулу объемный эквивалент буфера С. Затем выбейте гранулу с помощью пипетки в чистом гомогенизаторе.

Используйте от пяти до 10 плотных ударов пестика для восстановления. Суспензируйте гранулу. Переложите гомогенат в охлажденную пробирку и перемешайте путем инверсии в течение 30 минут.

При четырех градусах Цельсия можно использовать пластину для перемешивания. Если объем достаточно большой, переложите лизат в ультрацентрифужную пробирку UltraClear и при четырех градусах Цельсия открутите его в течение 30 минут. При концентрации около 25 000 г надосадочная жидкость представляет собой ядерный экстракт.

Следуя текстовому протоколу, завершите диализ всего из одного микрограмма шаблона. Подготовьте зонд путем транскрипции in vitro с помощью набора с совместимым промотором SP six или T seven. При загрузке страницы используйте три микролитра маркера и все 25 микролитров реакции на каждый субстрат РНК.

Кроме того, предотвратите перекрестное загрязнение, разделив полосы расшифровок одинакового размера. Запустите гель таким образом, чтобы зонд на 600 нуклеотидов работал на мощности 25 Вт в течение примерно двух часов. Чтобы отметить расположение гелевых лент, подсвечите экспонируемую пленку световым коробом и положите сверху обернутый гель.

Совместите автоматический маркер рада и экспонированный маркер на пленке. А затем отметьте места расположения полос черным маркером, чтобы снять полосы Разверните гель. И с помощью чистого лезвия вырезаем ленточные секции геля, переносим каждую секцию в отдельную пробирку и элюируем РНК в соответствии со стандартными процедурами.

После того, как все реагенты будут подготовлены, нагрейте меченую РНК до 80 градусов Цельсия в течение двух минут. Затем перенесите РНК в ледяной вихрь, 10% ПВА, а затем вращайте его на высокой скорости в течение нескольких минут, чтобы удалить пузырьки, затем приступайте к созданию мастер-смесей для каждой реакции. На каждую реакцию дозируйте 5,25 микролитров master mix по одному.

Далее добавьте 6,25 микролитров смеси ядерного экстракта. Затем добавьте микролитр разбавленного субстрата меченой РНК до 50 аномоляров в целом. В каждой реакции используется менее пяти аномолярных меченых РНК.

Теперь аккуратно закрутите и быстро раскрутите реакционные смеси. Дайте реакции протекать в течение двух часов при температуре 30 градусов Цельсия. Использование протеиназы К для переваривания белка в реакции и последующей очистки реакции Используя метод фенолхлороформа, выведите продукты на 6%-ную загрузку, три микролитра маркера или пять микролитров на продукт реакции на дорожку.

Затем запустите гель и позже аккуратно разберите гелевый аппарат. Чтобы собрать гель, плотно прижмите к нему фильтровальную бумагу и переверните. Плотно прижмите стекло, чтобы гель полностью захватил бумагу.

Затем медленно снимите фильтровальную бумагу с прикрепленным гелем. Оберните открытую сторону геля в полиэтилен и прикрепите пленку к фильтровальной бумаге с другой стороны. В завершение поместите гель в сушилку на 15 минут фильтровальной бумагой к вакууму.

Позже проанализируйте гель, подвергнув его воздействию пленки или фосфографического имиджера. Расщепленные. РНК-субстрат является самой медленно мигрирующей полосой в верхней части геля.

Специфический расщепленный продукт, отмеченный жирной стрелкой, быстрее стекает в гель при ожидаемом размере. Этот продукт отсутствует в контроле с точечной мутацией в последовательности Полье. Количественная оценка активности расщепления была определена с помощью метрического графика DS.

Сравнение соотношения расщепленной и расщепленной РНК, нормализованных к контрольной расщепленной РНК. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ полиаденилирования, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как активность полиА-полимеразы. Этот анализ проводится путем изменения условий реакции, таких как добавление магния и удаление ЭДТА.