Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 'Конец расщепление пре-мРНК подложках В пробирке
May 3rd, 2014
РНК-полимераза синтезирует II РНК-предшественник, который выходит за пределы конца 3'зрелой мРНК. Конец зрелой РНК генерируется cotranscriptionally, на участке, диктуемого последовательностей РНК, с помощью эндонуклеазы активности расщепления комплекса. Здесь мы подробно метод для изучения реакции расщепления в пробирке.
Общая цель этой процедуры заключается в успешном исследовании расщепления трех основных мРНК in vitro. Это достигается путем получения сначала транскрипционно активного ядерного экстракта из клеток, выращенных в суспензии. Вторым этапом процедуры является создание радиометеных субстратов РНК с помощью транскрипции in vitro.
Третий шаг заключается в очистке гелем помеченных РНК-субстратов. Заключительным этапом является сборка реакции расщепления, включающей ядерный экстракт и субстрат меченой РНК. В конечном счете, результаты могут показать три основные мРНК, расщепленные субстраты UNC и расщепленный продукт с помощью вертикального электрофореза радиоактивным гелем.
Визуальная демонстрация этого метода важна, несмотря на то, что он выполняется с 1980-х годов, его нелегко выполнить, так как на протяжении всей процедуры есть много специфических этапов, которые являются сложными. Имеют промытые ячейки, гранулированные и готовые к лизингу. Чтобы начать этот протокол с клеточной гранулы, добавьте буфер со свежим DTT.
Добавьте пять объемов расчетного CPV и с помощью пипетки разбейте гранулу и дайте суспензии остыть на льду. Через 10 минут раскрутите ячейки при температуре четыре градуса Цельсия в качающемся ведре. Центрифугой осторожно отсасывайте надосадочную жидкость.
Гранула впитает в себя некоторое количество раствора и увеличится в размерах. Затем добавьте одну CPV буфера А и аккуратно разбейте гранулу наконечником пипетки. Вылейте суспензию в охлажденный гомогенизатор и пятью-12 ударами плотного пестика проведите по клеткам.
Снимите небольшую аликвоту, нанесите триановый синий и проверьте клетки, чтобы определить полноту их лизиса. При необходимости продолжайте гомогенизацию клеток до тех пор, пока они не будут лизированы на 90%, но не переусердствуйте. Теперь переложите лизат в ультрапрозрачную ультрацентрифужную пробирку.
Запишите общий объем и вращайте его, как это было сделано ранее. Отсадите мутную надосадочную жидкость и сохраните ее на льду. А при анализе цитозоля будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу.
Он содержит ядра. Далее раскрутите дробину на высокой скорости в течение 15 минут. Удалите небольшой объем оставшейся надосадочной жидкости и объедините его с коллекцией цитозоля.
Затем определите ядерный объем PACT. Добавьте в гранулу объемный эквивалент буфера С. Затем выбейте гранулу с помощью пипетки в чистом гомогенизаторе.
Используйте от пяти до 10 плотных ударов пестика для восстановления. Суспензируйте гранулу. Переложите гомогенат в охлажденную пробирку и перемешайте путем инверсии в течение 30 минут.
При четырех градусах Цельсия можно использовать пластину для перемешивания. Если объем достаточно большой, переложите лизат в ультрацентрифужную пробирку UltraClear и при четырех градусах Цельсия открутите его в течение 30 минут. При концентрации около 25 000 г надосадочная жидкость представляет собой ядерный экстракт.
Следуя текстовому протоколу, завершите диализ всего из одного микрограмма шаблона. Подготовьте зонд путем транскрипции in vitro с помощью набора с совместимым промотором SP six или T seven. При загрузке страницы используйте три микролитра маркера и все 25 микролитров реакции на каждый субстрат РНК.
Кроме того, предотвратите перекрестное загрязнение, разделив полосы расшифровок одинакового размера. Запустите гель таким образом, чтобы зонд на 600 нуклеотидов работал на мощности 25 Вт в течение примерно двух часов. Чтобы отметить расположение гелевых лент, подсвечите экспонируемую пленку световым коробом и положите сверху обернутый гель.
Совместите автоматический маркер рада и экспонированный маркер на пленке. А затем отметьте места расположения полос черным маркером, чтобы снять полосы Разверните гель. И с помощью чистого лезвия вырезаем ленточные секции геля, переносим каждую секцию в отдельную пробирку и элюируем РНК в соответствии со стандартными процедурами.
После того, как все реагенты будут подготовлены, нагрейте меченую РНК до 80 градусов Цельсия в течение двух минут. Затем перенесите РНК в ледяной вихрь, 10% ПВА, а затем вращайте его на высокой скорости в течение нескольких минут, чтобы удалить пузырьки, затем приступайте к созданию мастер-смесей для каждой реакции. На каждую реакцию дозируйте 5,25 микролитров master mix по одному.
Далее добавьте 6,25 микролитров смеси ядерного экстракта. Затем добавьте микролитр разбавленного субстрата меченой РНК до 50 аномоляров в целом. В каждой реакции используется менее пяти аномолярных меченых РНК.
Теперь аккуратно закрутите и быстро раскрутите реакционные смеси. Дайте реакции протекать в течение двух часов при температуре 30 градусов Цельсия. Использование протеиназы К для переваривания белка в реакции и последующей очистки реакции Используя метод фенолхлороформа, выведите продукты на 6%-ную загрузку, три микролитра маркера или пять микролитров на продукт реакции на дорожку.
Затем запустите гель и позже аккуратно разберите гелевый аппарат. Чтобы собрать гель, плотно прижмите к нему фильтровальную бумагу и переверните. Плотно прижмите стекло, чтобы гель полностью захватил бумагу.
Затем медленно снимите фильтровальную бумагу с прикрепленным гелем. Оберните открытую сторону геля в полиэтилен и прикрепите пленку к фильтровальной бумаге с другой стороны. В завершение поместите гель в сушилку на 15 минут фильтровальной бумагой к вакууму.
Позже проанализируйте гель, подвергнув его воздействию пленки или фосфографического имиджера. Расщепленные. РНК-субстрат является самой медленно мигрирующей полосой в верхней части геля.
Специфический расщепленный продукт, отмеченный жирной стрелкой, быстрее стекает в гель при ожидаемом размере. Этот продукт отсутствует в контроле с точечной мутацией в последовательности Полье. Количественная оценка активности расщепления была определена с помощью метрического графика DS.
Сравнение соотношения расщепленной и расщепленной РНК, нормализованных к контрольной расщепленной РНК. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ полиаденилирования, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как активность полиА-полимеразы. Этот анализ проводится путем изменения условий реакции, таких как добавление магния и удаление ЭДТА.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование сосредоточено на исследовании тройного разреза мРНК in vitro, являющимся важным процессом в созревании РНК. Метод включает использование транскрипционно активного ядерного экстракта и радиомаркированных РНК-субстратов для анализа реакций разрезания.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология РНК
- Молекулярная биология
- Биохимия
Фон
- РНК-полимераза II синтезирует предшественническую РНК, которая выходит за пределы 3'-конца зрелой мРНК.
- Комплекс разрезания определяет сайт для образования зрелой РНК.
- Котраскрипционные процессы необходимы для созревания РНК.
- Понимание реакций разрезания может дать представление о механизмах обработки РНК.
Цель исследования
- Исследовать тройной разрез мРНК in vitro.
- Понять роль ядерных экстрактов в обработке РНК.
- Анализировать продукты реакций разрезания с помощью гелевого электрофореза.
Используемые методы
- Подготовка транскрипционно активного ядерного экстракта из клеток, выращенных в суспензии.
- Синтез радиомаркированных РНК-субстратов путем in vitro транскрипции.
- Гелевая очистка маркированных РНК-субстратов.
- Сборка реакций разрезания с ядерным экстрактом и маркированными РНК-субстратами.
Основные результаты
- Наблюдалось успешное разрезание тройных мРНК-субстратов.
- Результаты анализировались с помощью вертикального радиоактивного гелевого электрофореза.
- Были определены разрезанные субстраты и продукты разрезания UNC.
- Методология предоставляет основу для исследования реакций разрезания РНК.
Выводы
- Это исследование описывает надежный метод для исследования разрезания мРНК in vitro.
- Понимание механизмов разрезания может улучшить знания об обработке РНК.
- Результаты вносят вклад в более широкую область биологии РНК.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
