Выделение СА1 ядерного Обогащенный фракций из срезов гиппокампа для изучения деятельности зависит от ядерного импорта из Synapto-ядерных Messenger, белков

Мы предоставляем подробный протокол для индукции длительной потенциации в СА1 области гиппокампа и последующего выделения ядерных обогащенных фракций от tetanized области среза. Этот подход может быть использован для определения активности в зависимости импорт ядерного белка в клеточных моделей обучения и памяти.

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении зависимой от активности ядроцитоплазматического челночного перемещения белков с использованием острых срезов гиппокампа, где хорошо сохраняются нейронные связи и функции. Срезы гиппокампа переносятся в регистрирующую камеру, и поздняя форма LTP индуцируется в атоме CA в один слой ради. Затем потенцированные и контрольные срезы замораживают, а стимулированные участки рассекают с целью выделения обогащенной ядерными веществами фракции для дальнейшего иммуноблоттинг-анализа.

Результаты, основанные на вестерн-блоттинге, показывают различия в уровнях ядерных фосфопротеинов между потенцированными и контрольными срезами через 30 минут после индукции LTP. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности по двум причинам. Во-первых, малое количество образца ткани, а во-вторых, критические временные рамки, которые повторяются для лизиса образцов в буфере для гипотонического лизиса, позволяющие высвобождать ядра. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку подготовка гиппокампа к жизни и изоляция области С-1 требуют быстрых и очень точных вскрытий, но есть определенные хитрости.

Чтобы облегчить эту задачу, необходимо следовать как письменным, так и визуализированным инструкциям по приготовлению обогащенной ядерной фракции из С-1 области гиппокампа. Демонстрация процедуры лизиса будет выполнена почтовой лабораторией pinon. Она покажет, как подготовить острый лизис гиппокампа и индуцировать ЛТП.

После вскрытия одной области через Берра студент из нашей лаборатории покажет вам, как изолировать ядерное оружие и разрушение. Начните эту процедуру с изоляции мозга крысы и погрузите его в предварительно газированный ледяной раствор для взгляда. Далее удаляют мозжечок и часть энтеральной коры.

Отделите корковые полушария средним сагиттальным разрезом. После этого сделайте надрез под углом от 50 до 70 градусов вдоль спинного края каждого полушария. Затем положите каждую полусферу вниз на ее медиальную поверхность, приклейте каждую полусферу со свежевырезанной поверхностью на платформу для нарезки вибрато.

Затем накройте платформу предварительно карбогенированным раствором для холодного взгляда. Разрежьте с помощью вибрама срезы размером 350 мкм, содержащие субулярную и энтеральную кору гиппокампа, с передней на заднюю сторону. После этого переложите срезы в U-образный инкубатор погруженного типа и инкубируйте их не менее двух часов при температуре 32 градуса Цельсия с помощью карбогена А СМЖ.

Теперь перенесите срез гиппокампа в камеру погружного типа, установленную под микроскопом. Перфузировал ломтик с газированным А ликвором в дозе шесть миллилитров в минуту в течение не менее 30 минут при температуре 32 градуса Цельсия. Через 30 минут заполните стеклянные капиллярные микроэлектроды ликвором.

Поместите микроэлектрод в СА с одним коллатеральным волокном Шефера для стимуляции, а другой — с одним пластом готового атома для регистрации полевых EPSP на расстоянии 300 микрометров друг от друга. Затем вызовите полевые EP SSP, подав от трех до четырех вольт с помощью фазических прямоугольных импульсов тока к коллатеральным волокнам Шафера. Проведите тест на максимальную стимуляцию, измерив отношение выходного сигнала на входе, и определите силу стимуляции как 40% от максимального значения наклона EPSP на поле.

Затем запишите исходный уровень в течение не менее 15 минут, измеряя реакцию на тестовые стимулы каждую минуту на протяжении всего эксперимента. Чтобы индуцировать позднюю LTP, применяйте высокочастотный тейн для увеличения вызванных полей EPSP примерно в одной области. Нанесите пять микромоляров с помощью COE на спинномозговую жидкость А за две минуты до тетина и смойте сразу после последнего столбняка.

Остановите запись. Через две или 30 минут после поздней индукции LTP снимите электроды и быстро перенесите ломтик на предварительно охлажденную металлическую платформу, помещенную на сухой лед. Затем соберите каждый ломтик в пробирку объемом 1,5 миллилитра и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

На этом этапе извлеките замороженные ломтики из отрицательных 80 градусов Цельсия и держите их на льду. Добавьте в пробирку 0,5 миллилитра свежего холодного буфера TBS, содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы. Инкубируйте их в течение двух-трех минут, прежде чем перенести в стереомикроскоп.

Затем рассеките одну область гиппокампа в одном слое parama dole, удерживая срез одной иглой и разрезая одну область другой в одной области. После этого соберите рассеченные примерно одну область из пяти срезов на группу в новую одноточечную миллилитровую пробирку, содержащую 50 микролитров буфера для лизиса. Затем гомогенизируйте собранные ткани путем тщательного пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки объемом 200 микролитров.

Инкубируйте лизат на льду в течение пяти-семи минут, чтобы дать клеткам набухнуть. После этого возьмите два микролитра лизата и капните его на предметное стекло микроскопа. Визуализируйте набухание клеток под светлопольным микроскопом.

Ядра выглядят как круглые неповрежденные структуры с соответствующим набуханием. Теперь соберите 20 микролитров образца в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра в качестве гомогенатной фракции. Добавьте восемь микролитров денатурирующего четыре образца XSDS буфера.

Затем центрифугируйте оставшийся лизат при 1100 RCF в течение одной минуты. Через одну минуту аккуратно соберите надосадочную жидкость сверху и переложите ее в новую трубку. Затем добавьте 20 микролитров четырех x буфера для проб.

Затем ресуспендируйте гранулу в 60 микролитрах гипотонического буфера и добавьте 20 микролитров четырех х пробного буфера. Эта фракция называется фракцией, обогащенной ядрами. Храните гомогенатные, цитозольные и обогащенные ядерными веществами фракции при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия.

Для последующего иммуноблоттинга в этой процедуре разморозьте образцы и кипятите их в течение пяти минут при 95 градусах Цельсия перед измерением концентрации белка с помощью теста AM mito black, или тестовой нагрузки BCA, равного количества образцов белка из гомогенатной, цитоплазматической и обогащенной ядерными фракциями. На странице SDS образцы геля из контрольного и LTP срезов должны быть помещены на один и тот же гель для прямого сравнения в вестерн-блоттинге. На этом рисунке показан иммуноблоттинг для гомогенатных, цитозольных и обогащенных ядрами лизата caone lysate, зондированных цитозольными и ядерными маркерами.

Это иммуноблоттинг-анализ уровня PJS 180 в гомогенате через две минуты и 30 минут после индукции теина, а это иммуноанализ крови на уровень PJS 180 в ядерно-обогащенной фракции. Через 2 минуты и 30 минут после издания уровни фосфо Якоба оставались неизменными в общем объеме СА одного белка гомогенатов, а в обогащенной ядрами фракции через две минуты после издания. Но было обнаружено значительное повышение иммунореактивности p Jacob, S 180 через 30 минут после индукции LTP.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить об использовании соответствующего объема гипотонического лизисного клапана. Кроме того, необходимо стандартизировать критические временные рамки для лизиса образцов. В частности, когда этот метод применяется для выделения ядер и фракций из образцов ткани мозга крысы или мыши, отличных от гиппокампа, после этой процедуры могут быть полезны другие методы, такие как комплементарное иммунное окрашивание антителами против белков-кандидатов, импортированных в ядро после индукции OTP, или сигнальные молекулы, такие как активные формы киназы или фосфатазы, могут быть полезны для проверки этих результатов.

Для ответа на дополнительные вопросы может быть проведено фармакологическое лечение. Например, какие сигнальные каскады участвуют в транслокации синаптических ядерных белков или как они влияют на ядерную функцию. Кроме того, можно было бы изучить роль белков-мессенджеров синапа в заболевании гиппокампа.

Например, болезнь Альцгеймера.