Эндотелия Формирование Анализ сотового трубка для

Общая цель данной процедуры заключается в определении генов или сигнальных путей, участвующих в ангиогенезе, с использованием экспресс-метода количественного анализа in vitro. Для этого сначала, за день до проведения анализа, проводят сывороточное голодание первичных или иммортализованных эндотелиальных клеток. На втором этапе эндотелиальные клетки инкубируют с кальцином в течение 30 минут, после чего клетки промывают PBS.

Затем эндотелиальные клетки подвергают трипсинизации, фильтруют для удаления агрегатов и подсчитывают. Заключительный этап заключается в объединении эндотелиальных клеток с кондиционированной средой, содержащей возможные ангиогенные факторы, и их распределении по застывшему экстракту базальной мембраны. В конечном итоге для визуализации сетей трубок используется световая или флуоресцентная микроскопия, после чего полученные данные квантифицируют с помощью специализированных компьютерных программ.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими способами анализа ангиогенеза является простота настройки, относительная дешевизна, образование трубочек в течение нескольких часов и возможность количественной оценки, что и демонстрируется в данной технике. Эрика Буллвинкль, аспирант кафедры биологии Американского университета. Используя подходящую среду, перенесите три клетки B 11 в новую колбу за два дня до начала анализа; для достижения наилучших результатов следует использовать клетки от второго до шестого пассажа.

Затем культивируйте клетки в течение 24 часов в дополненной среде dmm. После достижения клетками необходимого состояния проведите сывороточное голодание. Заменив среду на среду с пониженным содержанием сыворотки, культивируйте клетки в условиях голодания еще в течение 24 часов.

Для достижения наилучших результатов важно подтвердить у производителя, что концентрация стокового раствора BME составляет 10 mg/mL. Разморозьте восстановленный фактор роста BME в холодильнике. Поскольку BME затвердевает при нагревании, перед использованием его следует хранить в охлажденном виде.

Затем разморозьте среду, необходимую для анализа с использованием флуоресцентной или конфокальной микроскопии, и добавьте в среду calcein AM до конечной концентрации 2 µg/mL. Выдержите клетки, меченные calcein AM, в темноте примерно 30–45 минут. По истечении этого времени удалите среду и промойте клетки 3B11 в DPBS. Затем проведите трипсинизацию клеток, добавив 1 mL трипсина-EDTA; дождитесь завершения процесса трипсинизации.

Ресуспендируйте клетки до конечного объема 10 мл в дополненной среде dmm. Удалите любые скопления клеток, профильтруйте их через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм. После подсчета клеток ресуспендируйте их до необходимой конечной концентрации для начала анализа формирования трубок.

Подготовьте 24-луночный планшет и наконечники на один миллилитр за 20–30 минут до загрузки. Это предотвратит преждевременное затвердевание BME в момент начала работы; с помощью пипетки внесите 250 microliters BME с восстановленным фактором роста в каждую лунку 24-луночного планшета. Избегайте образования пузырьков, не нажимая на поршень пипетки до упора.

При дозировании, после заполнения лунок, убедитесь, что в центре лунки осталось достаточное количество BME. Если при формировании мениска матрикс окажется слишком тонким, клетки сформируют только монослой. Затем инкубируйте планшет в течение 30 минут для затвердевания BME.

После застывания BME смешайте примерно 300 мкл кондиционированной среды с 10 мкл ресуспендированных клеток three B 11 и распределите клеточную суспензию по лункам планшета. После помещения планшета в инкубатор трубки начнут формироваться в течение двух-четырех часов. В зависимости от концентрации ангиогенного фактора в кондиционированной среде пик формирования трубок может наступить через 3–12 часов. Время проведения анализа необходимо оптимизировать для конкретных условий исследования.

Трубки часто начинают разрушаться в течение 18 часов, и эндотелиальные клетки подвергаются апоптозу в момент пика формирования трубок. Осторожно аспирируйте среду из лунки, чтобы не нарушить сеть трубок. Затем промойте каждую лунку одним миллилитром DPBS для последующей визуализации.

Добавьте по одному миллилитру свежего DPBS в каждую лунку и снимите изображение сети трубок на конфокальном микроскопе, чтобы зафиксировать сеть трубок для последующей визуализации. Добавьте 4% паральдегид в каждую лунку после аспирации и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. После удаления параформальдегида дважды промойте лунки раствором DPBS, а затем добавьте по одному миллилитру свежего DPBS в каждую лунку. Эти изображения показывают, что ангиогенные факторы, секретируемые кератиноцитами или фибробластами мыши, способны индуцировать формирование трубок.

Со временем эндотелиальные клетки мигрируют и начинают образовывать небольшие ветвления в течение одного-двух часов после посева. Максимальное формирование трубок наблюдалось через четыре-шесть часов. К 24 часам некоторые ветвления сохранились, однако многие клетки подверглись апоптозу, и трубки начали распадаться.

Количество клеток оказывает глубокое влияние на формирование трубок. При посеве недостаточного количества клеток образуется мало трубок и сеть минимальна; по мере увеличения количества посевных клеток трубчатая сеть становится более разветвленной. Однако при слишком высокой концентрации клетки начинают слипаться или образовывать монослои, что маскирует различия между опытными группами. Для обеспечения адекватного формирования трубок клетки должны пройти минимум два пассажа.

Скорость роста линии B 11 настолько высока, что пассаж 25% клеток приведет к достижению конфлюэнтности во флаконе уже на следующий день. В данном случае для анализа сети трубок, окрашенных кальцеином AM, используется программа Image J с плагином angiogenesis для определения общего количества узлов, трубок в сетке в совокупности и слияний в сети. Кроме того, эта программа может быть использована для индивидуального обнаружения и количественной оценки узлов, трубок или сетки.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как быстро и надежно проводить анализ ангиогенеза in vitro, избегая при этом распространенных ошибок.