АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

Общая цель этой процедуры заключается в картировании механических свойств растительных тканей с помощью атомно-силового микроскопа. Сначала приготовьте предметные стекла путем пипетирования капли с низкой температурой плавления ароса на травленую область предметного стекла с образованием тонкой пленки арос. Второй шаг — препарирование и монтаж образца.

Удалите цветочные бутоны со стебля, срежьте стебель марриса подальше от стебля и сразу же заделайте срезанный стебель в тонкую пленку Агрос на стекле. Далее проведите горкой, добавьте достаточно расплавленного крепежа агроса, чтобы заполнить трещину, образовавшуюся при погружении стебля Мариса в пленку Арос. Заключительным этапом является настройка атомно-силового микроскопа для сбора данных.

В конечном счете, анализ данных и измерения кажущегося модуля Юнга клеточных стенок создают механическую карту свойств клеточных стенок одновременно при субклеточном разрешении и во всех областях ткани. Основное преимущество этой методики перед существующим методом заключается в том, что она позволяет измерять механические свойства клеточной стенки одновременно в субклеточном разрешении и по всей области ткани. Среда Aros для заделки образцов готовится при низкой температуре плавления 0,7%, при этом в воде содержится 10% маннита.

С помощью прочного металлического инструмента, такого как наконечник сверла, вытравите участок размером 0,5 на 0,5 сантиметра в центре микроскопического стекла. Слайд делает поверхность шероховатой, чтобы облегчить сцепление агроса, чтобы гарантировать, что агрос прилипает или фиксируется к слайду. Пипеда капли объемом около 20 микролитров заделки агроса на протравленную область предметного стекла.

В результате получается тонкая пленка агроса. Храните предметное стекло во влажной коробке и подождите, пока фильтрующий материал Agros затвердеет из образцов Arabidopsis. Ana будет использоваться для атомно-силовой микроскопии для подготовки образцов меристем.

Удаляйте цветочные бутоны один за другим со стебля, потянув их вниз ультратонким пинцетом. Важно удалить все цветочные бутоны вплоть до бутонов, которые не проявляют последствий, известных как P one stage primor. С помощью лезвия бритвы или кончика пинцета отрежьте меристему от стебля.

Срез должен быть параллелен той области поверхности меристемы, которая должна быть измерена с помощью атомно-силового микроскопа или FM. Полученная вершина должна быть от 300 до 600 микрон в высоту, чтобы она не рассыпалась во время эксперимента. Сразу же вдавите верхушку в тонкую пленку арос подготовленной ранее среды. Выберите положение на предметном стекле или аросе и осторожно надавите так, чтобы меристема находилась в непосредственном контакте со стеклом и выступала из арос.

Агрос ломается под давлением, поэтому стебель мари теперь будет стоять в трещине. Очень важно расположить стебель марита в аросе в течение нескольких секунд после его срезов от стержня. Это предотвращает высыхание стебля МА.

Таким образом можно подготовить несколько стеблей MA для пакетной визуализации, при условии, что они имеют одинаковую высоту и расположены на расстоянии менее 500 мкм друг от друга. На предметном стекле храните подготовленные стебли ма во влажной коробке, пока вы будете препарировать дальнейшие образцы. Прежде чем перейти к следующему шагу, используйте фильтровальную бумагу, чтобы аккуратно удалить лишнюю воду на границе между меристемой и цветочными бутонами.

Это необходимо для того, чтобы расплавленный агрос не затопил пробу из-за капиллярных сил. В дальнейшем с помощью пипетки объемом 20 мкл при достаточно расплавленном монтаже агроса заполнить образовавшуюся ранее трещину и окружить каждую меристему, арос должен достичь уровня рубца от удаленного цветочного бутона или примора гим. Чтобы добиться этого, может потребоваться добавить агрос на каждом конце трещины.

Когда агрос добавляется, он быстро заливается в трещину. С помощью пипетки отсасывайте часть расплавленного крепежа агроса, чтобы убедиться, что стебель me находится в самой высокой точке на предметном стекле. Это фиксирует стебель me, так что он не может двигаться во время визуализации корней и гипо-початков.

В тонкой пленке агроса не требуется никакого рассечения. На подготовленном предметном стекле с помощью микропинцета сделайте углубление либо непосредственно над травлением в стекле, либо вдоль стеклянной ламели расположите корень или гипо-чайник в этом углублении, следя за тем, чтобы он соприкасался со стеклом по всей длине его удержания. Добавьте расплавленные монтажные агро вокруг образца таким же образом, как показано на примере стебля.

Нано-мастер JP PK. В этой демонстрации используется FM. Чтобы начать эту процедуру, установите консоль с круглым наконечником на A FM. Радиус определяет разрешение X, Y, Z и глубину вдавливания, на которой точное измерение может быть заархивировано.

Для проведения мезо- и наноразмерных измерений на поверхности эпидермиса используйте круглый протез радиусом 50 нанометров. Для проведения мезомасштабных измерений используйте круглый протез радиусом 0,5 микрона, а для проведения микромасштабных измерений в двух-трех ячейках используйте круглый наконечник радиусом 2,5 микрона, расположив лазер на кончике консоли. Выровняйте лазер по центру захватчика с помощью зеркала.

Расположите чистое стекло под заход A FM с мишенью на заданное значение в одно вольт, выберите для спектроскопии. Выполните вдавливание, установив максимальную относительную установочную точку равной двум вольтам, скорость расширения до 40 микрон в секунду и длину Z равной пяти микронам. В меню диспетчера калибровки выберите линейную часть прямой кривой в соответствии с чувствительностью.

С помощью кнопки выбора подходящего диапазона относительная уставка должна быть преобразована из объема в метр при 200 микролитрах 10% раствора манитола. Под консольным наконечником переместите лазер в середину захватчика с помощью зеркала и, переместив угасающего, повторно откалибруйте чувствительность в меню диспетчера калибровки. Нажмите на неизвестную кнопку, выберите четыре спектроскопии и выполните индентирование, как показано ранее.

Выберите линейную часть прямой кривой в соответствии с чувствительностью с помощью кнопки выбора диапазона подгонки, чтобы начать эту процедуру, расположите смонтированные образцы под A FM и добавьте на образцы каплю 10% раствора манитола объемом 500 микролитров. Раствор манитола плазмы клеток в течение нескольких минут приближается к заданной точке в 20 наноньютонов в денту с относительной заданной точкой 200 наноньютонов и удлиняется со скоростью 40 мкм в секунду и длиной Z в пять мкм. Отрегулируйте относительную уставку, чтобы получить отступ 100 нанометров для консоли, установленной на 200 нанометров, или 0,5 микрона для одного микрона.

Режим отображения силы на кантилевре на пяти микронах. Выберите область для сканирования на наличие маргинальных стеблей 70 на 70 мкм с разрешением 64 на 64 для hypo cos и корней 100 на 100 мкм с разрешением 64 на 64. Нажмите кнопку сканирования, чтобы запустить эксперименты, сохраните вывод.

Начните с открытия файла данных в программном обеспечении для анализа данных. Затем выберите пакетную обработку. Применение одного и того же анализа ко всем кривым одной карты.

Выберите правильную высоту для изгиба консоли, чтобы извлечь глубину вмятины. Выберите функцию подгонки по модулю Юнга. При этом предполагается, что сила пропорциональна площади вмятины.

Установите параболическую форму наконечника, чтобы предположить, что форма углубления является параболой. Укажите радиус наконечника. Затем выберите кривую отвода для анализа.

Кривая втягивания предпочтительнее кривой xtend, поскольку она менее чувствительна к топографии. Установите коэффициент посо равным 0,5. Наконец, нажмите на кнопку, проанализируйте и сохраните результат.

Типичные для молодых A FM модульные карты цветочных стеблей Марса, молодых и старых гипо-початков и корневых стеблей MA показаны здесь во всех экспериментах. Договор имеет полусферическую форму, но его радиус различается, что позволяет достичь разного пространственного разрешения. Эти карты показывают типичные результаты для мезо- и наноразмерных отверстий радиусом 50 нм с углублениями глубиной 50 нм.

Кардиограф выявляет микромасштабные гетерогенности в поверхностных клеточных стенках гипокодальных эпидермальных клеток. Также показаны типичные результаты для мезомасштабных венцов с радиусом 500 нм с углублениями глубиной 500 нм для цветочной меристемы, гипо-кодла и корня. Этот кардиограф для микроразмерных протезов с радиусом 2,5 микрона и углублениями глубиной 500 нанометров выявил размягчение тканей во время инициации органа, которое предшествовало любому видимому росту.

Однако это сканирование было прервано из-за того, что диапазон высоты образца превысил максимальный диапазон Z A FM. Движение образца во время эксперимента из-за неправильной фиксации может привести к размытому сканированию, как показано здесь. Регионы, покрытые агросом, также не могут быть правильно измерены, как показано в этом примере. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет освоить за один час, если все правильно выполнить.