Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Общей целью данного эксперимента является определение внутриклеточных или внеклеточных уровней аскорбата в культивируемых или изолированных клетках. Это достигается путем инкубации клеточных экстрактов или целых клеток с оценочной оксидазой для селективного истощения БА на последующих стадиях. В первом способе клеточные экстракты инкубируют с цианидом для получения ферроцианида аскорбатно-зависимым образом, что дает прямое представление о количестве аскорбата в экстрактах.

Затем количество ферроцианида, образующегося в клеточных экстрактах, определяют путем количественного окисления ферроцианида с добавлением трехвалентного железа с образованием железа с целью получения хромогенного комплекса железа и двух ферн S, который может быть количественно определен спектрально фотометрически. При втором методе все клетки непосредственно инкубируются с железом из двух хелататоров ферна S и цитратом железа. Результаты показывают различия во внутриклеточных или внеклеточных уровнях аскорбата, основанные на количественном и специфическом снижении внеклеточных комплексов железа, которое может быть обнаружено.

Спектрометрический спектр. Основное преимущество текущего метода по сравнению с уже существующими методами, такими как обнаружение на основе HBLC, заключается в том, что этот высокоспецифичный анализ микропланшетов может быть проведен очень быстро, и все образцы и стандарты могут быть обработаны параллельно, а не серийно. Культивируют К 5 62 суспензии клеток и создают в балле БА, содержащую клеточный экстракт.

После этого приготовьте стоковый раствор 10 миллимолярной аскорбиновой кислоты в ледяном ПБС. Затем тщательно приготовьте серию аскорбатов стандартов от нуля до 20 микромоляров. Аккуратно извлеките по четыре аликвоты по 100 микролитров из каждой пробки и добавьте их в горизонтальную последовательность лунок.

В 96 лунках плоское дно пластины, которые содержат 25 микролитров на лунку PBS или 45,5 единиц на миллилитр. Стоковым раствором L аскорбатоксидазы или АО в ПБС покрыть 96 луночную пластину фольгой и орбиталью. Перемешивайте его при 550 об/мин при комнатной температуре в течение пяти минут.

Когда закончите, добавьте 50 микролитров 3,5 миллимолярного цианида ферриса калия в PBS во все лунки, чтобы получить конечную концентрацию цианида ферриса в один миллимоляр после орбитального перемешивания 96-луночной пластины, используя те же условия, что и раньше. Сразу же добавьте 25 микролитров свежеприготовленного раствора, содержащего 50% уксусной кислоты и 30% трихлоруксусной кислоты. Далее добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежеприготовленного раствора для определения цианида Pharaoh.

Перемешивайте тарелку в темноте при 550 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем считайте значения поглощения лунок на 593 нанометрах. Для начала проведения пробы.

Сначала окислите внеклеточный аскорбат в выбранных лунках, добавив 50 микролитров 120 единиц на миллилитр AO или HBSD в парные лунки в трех экземплярах, чтобы получить конечную концентрацию AO 10 единиц на миллилитр. Следуя этой метке, парные скважины получают как минус АО и плюс АО. После смешивания планшетов с помощью осторожного орбитального перемешивания в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия добавьте 50 микролитров 2,4 миллимоляра Ferne S во все лунки, чтобы получить концентрацию папоротника 200 микромоляров, перемешайте планшеты, как указано выше, в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.

Затем добавьте 50 микролитров свежеприготовленного 120 микромольного цитрата железа во все лунки, чтобы получить конечные концентрации железа и цитрата 10 микромолярного железа и 50 микромоляров цитрата соответственно. Хорошо перемешайте в конце анализа аскорбата FLX. Быстро отсасывайте вышележащую среду из каждой лунки и добавляйте в соответствующим образом маркированные лунки в 24-луночной пластине.

После этого добавьте три микролитра аликвоты надосадочной жидкости в 96-луночный планшет для определения внеклеточного аскорбата. Считывайте значения поглощения лунок на 593 нанометрах в микропланшетном спектрофотометре. Наконец, рассчитайте количество внеклеточного аскорбата в пересчете на показанный миллиграмм белка.

Вот типичная стандартная кривая для набора стандартов аскорбата, от нуля до 20 микромоляров или от нуля до двух НМО аскорбата на лунку. Из 96-луночной пластины, хотя здесь и не показана, линейность поддерживается на уровне до восьми НМО аскорбата на лунку, что соответствует концентрации аскорбата образца около 80 микромоляров. Анализ может быть использован для успешного определения уровней аскорбата ниже 0,25 оле аскорбата на скважину.

Клетки K 5 62 быстро накапливают внутриклеточный аскорбат из внеклеточного дегидро L-аскорбиновой кислоты, но не аскорбат. В этом репрезентативном эксперименте PBS промытые K 5 62 клетки инкубировали в PBS с 500 микромолями либо аскорбата дегидро L, либо аскорбиновой кислоты дегидро L, либо аскорбиновой кислоты плюс 50 микромоляров цито B аскорбата плюс пять миллимолярных цианидов или аскорбата плюс 50 единиц на миллилитр АО в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Внутриклеточный аскорбат определяли, как описано ранее.

Поглощение дегидро-L-аскорбиновой кислоты клетками K 5 62 происходит путем облегченного переносчика глюкозы, опосредованного переносчиком глюкозы, для оценки участия ягодичных мышц в поглощении дегидро-L-аскорбиновой кислоты. В этом репрезентативном эксперименте клетки K 5 62 инкубировали с возрастающими концентрациями цито B или дигидроцита B перед инкубацией с дегидро L-аскорбиновой кислотой. Важно отметить, что в то время как как цитокаллин В, так и дигидроцито В ингибируют подвижные процессы в микромолярных концентрациях, только цитокаллин В, который отличается от дигидроцитоцита В наличием одной двойной связи, ингибирует ягодозависимый транспорт при низких микромолярных концентрациях.

Таким образом, в качестве дегидро L поглощение аскорбиновой кислоты ингибировалось цито B с IC 50 менее 2,5 микромоляров, но не ингибировалось дигидроцитом. В дегидро. Поглощение L-аскорбиновой кислоты, вероятно, происходит за счет транспорта, опосредованного ягодичными мышцами.

В качестве альтернативы, промытые клетки подвергались воздействию возрастающих концентраций переносимого ягодичного, но не метаболизируемого аналога глюкозы трех O метил D глюкозы или неглютного транспортируемого глюкозного стереоизомера L глюкозы во время инкубации с дегидро L аскорбиновой кислотой. Опять же, полученные результаты указывают на участие glu в импорте дегидро L-аскорбиновой кислоты, поскольку ингибирование внутриклеточного накопления аскорбата происходит только в присутствии аналога глюкозы, переносимого в глуте. Во втором анализе.

Можно определить скорость оттока аскорбата из культивируемых клеток. Этот специфический анализ важен, поскольку высвобождение аскорбата из клеток, по-видимому, имеет решающее значение для регулируемого аскорбатом клеточного поглощения клетками железа, не связанного с трансферрином. Считается, что поглощение железа, не связанного с трансферрином, имеет отношение к патофизиологии расстройств, связанных с перегрузкой железом, таких как гемохроматоз, а также к обмену железа в астроцитарных нейронах и гомеостазу в мозге млекопитающих.

Действительно, основной возбуждающий нейромедиатор L глутамат вызывает высвобождение аскорбата для астроцитов таким образом, что это зависит от L-глутамата, поглощения стеклом и, вероятно, первого клеточного отека GLT и последующего клеточного отека, который вызывает высвобождение аскорбата предполагаемыми VSO. По аналогии, высвобождение A score bate из астроцитов, загруженных A score B, может стимулироваться возбуждающей аминокислотой L аспартатом, но не возбуждающей аминокислотой L глутамином. Этот эффект изображен на рисунке, который показывает кривые реакции на дозу для стимуляции высвобождения аскорбата аспартатом и глутамином из первичных культур аскорбатовых астроцитов мышей после освоения.

Эта техника может быть выполнена всего за два часа при правильном выполнении.