Подготовка ДНК-сшитый полиакриламидных гидрогелей

Общая цель этой процедуры заключается в получении сшитых ДНК полиакриламидных гидрогелей, которые могут застывать или размягчаться путем пипетирования одноцепочечных ДНК в питательную среду после того, как клетки будут покрыты сверху. Это достигается путем суспендирования сначала лиофилизированного SA одного, SA двух L, двух R, двух и контрольных одноцепочечных ДНК в буфере и индивидуальной полимеризации растворов SA one и SA 2 в полиакриламидный каркас. Второй шаг заключается в смешивании полимеризованных растворов SA one и SA two с раствором L two с образованием геля ДНК.

Затем раствор геля ДНК обездвиживается на стеколах стеклянной крышки с помощью оптического клея. Последним шагом является функционализация гелей путем обработки их sul sampa, а затем PDL. В конечном счете, клетки покрываются на гелях ДНК, и эластичность геля модулируется добавлением R two L, two или контрольной одноцепочечной ДНК для смягчения, жесткости или отсутствия изменения эластичности геля соответственно.

Преимущество использования этого метода по сравнению с другими методами, такими как CROs, жаргон, шариковые гидрогели, заключается в том, что гели ДНК не требуют такого стимула, как ультрафиолетовое излучение для модуляции их эластичности. Вместо этого гели ДНК затвердевают и размягчаются за счет диффузии одноцепочечной ДНК L two или R two через гель соответственно. Сначала центрифуга лиофилизировала SA одноцепочечную ДНК при 2000 GS в течение 15 секунд, чтобы гарантировать, что вся одноцепочечная ДНК находится на дне пробирки.

После центрифугирования приготовьте три миллимоляра раствора SA one, добавив в пробирку 107 микролитров одного буфера tris, EDTA или TE Нагрейте буфер SA one NTE при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут или до полного растворения одноцепочечной гранулы ДНК. После этого приготовьте один полимеризованный раствор SA, добавив 45 микролитров 40% акриламида и 18 микролитров 10 x трибо, ЭДТА или КЭБ буфера и центрифуги. Эту смесь облегчить перемешивание.

Вставьте наконечник P 200, присоедините его к источнику газообразного азота в растворе и медленно дайте газообразному азоту пройти через раствор в течение двух-трех минут. Затем центрифугируйте образец в течение 15 секунд при 2000 Gs для сбора раствора Когда закончите 4,5 микролитра 2% аммония на сульфат или PS для начала полимеризации геля, переверните пробирку несколько раз для перемешивания После центрифугирования образца для сбора раствора для однородной полимеризации добавьте 4,5 микролитра 20% тетраэтилметилена, После того, как образец подвергся, смешивание и центрифугирование. Дегазируйте раствор газообразным азотом в течение трех-пяти минут для полной полимеризации и минимизации нереактивных мономеров.

После этого инкубируют раствор в течение 10 минут при комнатной температуре до полной полимеризации и дают SA один полимеризованный раствор. Повторите предыдущие шаги с лиофилизированной SA двумя одноцепочечными ДНК, добавив 45, 18, 4, 0,5 и 4,5 микролитра акриламида T-B-E-A-P-S и TED соответственно к 108 микролитрам раствора SA 2. Для приготовления растворов L, 2, R, 2 и контрольных растворов центрифугируют, лиофилизированную, одноцепочечную ДНК и добавляют следующие количества TE-буфера к соответствующей лиофилизированной одноцепочечной ДНК, как описано ранее, нагревают раствор до растворения в гелеобразном растворе.

Препараты нагревают s sa one и SA two полимеризованные растворы при 70 градусах Цельсия в течение примерно одной минуты. До тех пор, пока вязкость раствора не уменьшится. Добавьте 10 микролитров или 10 частей одного полимеризованного раствора СА на 10 микролитров или 10 частей двух полимеризованных растворов.

Затем смешайте два полимеризованных раствора SA и SA два вместе, чередуя нагревание в течение 15 секунд при температуре 70 градусов Цельсия и перемешивание в течение 15 секунд с помощью наконечника для пипетки в общей сложности в течение одной минуты. После смешивания в шести микролитрах или шести частях 100%L два раствора образуют 100%-ный гель. После того как образец был перемешан, как описано выше, нанесите пипеткой 100%-ный гель в чашку Петри диаметром 60 мм и нагревайте гель в течение одного часа при оптимальной температуре отжига.

Затем позвольте сшивкам ДНК продолжить повторную гибридизацию, инкубируя гели в течение четырех часов при комнатной температуре. Накройте гель PBS, содержащим кальций в магнии, после инкубации в течение ночи при комнатной температуре, удалите остатки буфера из чашки Петри и поместите гель в микроцентрифужную пробирку. На этом этапе нагрейте 100% гель при температуре 70 градусов Цельсия в течение примерно 30 секунд или пока гель не станет менее вязким.

Для пипетирования поместите стеклянную крышку на термоблок с температурой 70 градусов Цельсия и дайте им нагреться в течение одной-двух минут. Добавьте каплю оптического клея на каждую стеклянную крышку. Затем добавьте 20 микролитров 100% геля в каждую стеклянную крышку, дайте гелю растаять и распределите по ним.

Извлеките каждый стакан с гелем из нагревательного блока и поместите их в 24-луночную чашку для культуры тканей. Подвергайте гели воздействию ультрафиолетового излучения с яркостью 365 нанометров в течение 15 минут. Нагрев гель в течение одного часа при оптимальной анальной температуре и позволив сшивкам ДНК повторно срастись в течение четырех часов, добавьте к ним PBS.

Затем инкубируйте гели в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации извлеките буфер из лунок с помощью пипетки, стараясь не допустить аспирации геля. Затем добавьте сульфаниламидную сампу, чтобы покрыть каждый гель.

После того, как гели подверглись воздействию ультрафиолетового излучения с яркостью 365 нанометров в течение 15 минут, удалите сульфаниламидную сампу. Промойте гели один раз с помощью PBS, чтобы удалить излишки сульфаниламидной сампы После повторения предыдущих шагов инкубируйте гели примерно в 300 микролитрах 0,2 миллиграмма на миллилитр поли-де-лицина в течение ночи при четырех градусах Цельсия Когда закончите, промойте гели дважды PBS в течение пяти минут, чтобы удалить избыток полилизина и добавить среду. После инкубации гелей в среде в течение 30 минут удалите среду непосредственно перед нанесением покрытия на клетки для культивирования клеток и визуализации.

Фибробласты, выращенные на гелях жесткости, не имели изменений в соотношении сторон, но демонстрировали большую площадь проекции, чем фибробласты, выращенные на 100% гелях. Фибробласты, выращенные на 100% гелях, имели меньшую площадь проекции и большее соотношение сторон, чем фибробласты, выращенные на 80% гелях. Эти результаты указывают на то, что поведение фибробластов зависит от динамической природы микроокружения.

Нейроны, выращенные на смягчающих гелях, не имели различий в числе первичных дендритов или длине аксонов, но демонстрировали более короткие первичные дендриты, чем нейроны, выращенные на 50%-ных гелях. Как и в исследованиях фибробластов, нейрофенотипы на статических гелях отличались от нейрофенотипов на динамических гелях. Нейроны, выращенные на 50% геле, имели меньше первичных дендритов и более длинные аксоны, чем нейроны, выращенные на 100% геле.

Несмотря на то, что попытка выполнить эту процедуру чрезвычайно важно помнить о необходимости точного пипетирования вязкого геля, поскольку концентрации важны для предотвращения разрыва геля, точное пипетирование может занять несколько попыток, и мы предлагаем несколько других вариантов в обсуждаемой части этого протокола.