Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Общая цель этой процедуры заключается в изучении механизмов рекрутирования лейкоцитов в эндотелиальных клетках печени человека при наличии физиологических уровней чистого стресса. Это достигается путем предварительного получения сливающегося монослоя эндотелиальных эндотелиальных клеток печеночного синусоидального толка человека в микропредметном стекле, который затем стимулируется воспалительными цитокинами. Вторым шагом является выделение лимфоцитов из периферической крови.

Затем микропредметное стекло подключается к системе проточного анализа и перфузируется лимфоцитами в присутствии физиологически значимого чистого стресса. Заключительным этапом является визуализация взаимодействий лимфоцитов в условиях потока с помощью фазово-контрастного микроскопа. В конечном счете, офлайн-анализ фазово-контрастных изображений, полученных в ходе анализа потока, используется для сравнения влияния различных ингибиторов на рекрутирование лимфоцитов в эндотелиальных клетках печени.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гепатологии, например, какие комбинации белков адгезии и хемокиновых рецепторов важны для рекрутирования различных иммунных клеточных популяций через синусоидальный эндотелий и в печеночную паренхиму. Применение этого метода распространяется на терапию хронических воспалительных заболеваний печени, большинство из которых обусловлено рекрутированием лимфоцитов в ткани печени. Понимание молекулярных механизмов может привести к новым противовоспалительным методам лечения.

Тем не менее, этот метод может дать представление о наборе воспалительных клеток в печень человека. Он также может применяться к другим типам клеток, таким как эндотелиальные клетки, выделенные из пупочной вены или других сосудистых русла. Для начала приготовьте рабочий раствор из 200 микрограмм на миллилитр коллагена крысиного хвоста, наберите один, разведя его из стокового раствора в стерильный PBS.

Затем введите 30 микролитров разведенного коллагена в каждый канал шестиканального микростекла и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем приготовьте полноценную среду, добавив в базальную среду эндотелия человека пенициллин L-глутамин и термоинактивированный стрептомицин, фактор роста эндотелия сосудов в сыворотке крови человека и фактор роста гепатоцитов. Затем с помощью трипсина ЭДТА собирают культивируемые эндотелиальные клетки печени человека из сливающейся колбы T 75, гранулируют клетки, промывают их в PBS, а затем повторно суспендируют в соотношении три раза по 10 шестых клеток на миллилитр в полной среде.

Затем промойте микропредметное стекло три раза PBS, а затем добавьте 30 микролитров клеточной суспензии в каждый канал микропредметного стекла, покрытого коллагеном. Оставьте клетки на один час во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% атмосферы CO2. После того, как ячейки прилипнут, заполните порты по обе стороны каждого канала полной средой и поместите их обратно в инкубатор на 24 часа.

Через 24 часа используйте инвертированный фазово-контрастный микроскоп, чтобы оценить, достиг ли рост клеток 80% плавности. Далее подготовьте цитокины для стимуляции клеток, добавив 10 нанограмм на миллилитр TNF альфа и 10 нанограммов на миллилитр, интерферон гамма к одному миллилитру готовой среды. Затем, за 24 часа до проведения анализа адгезии, заменили питательную среду для клеток 0,1 миллилитром питательной цитокиновой среды для стимуляции клеток, очистки мононуклеарной фракции из цельной крови путем центрифугирования градиента плотности при соответствующем разделении клеток, центрифугирующие среды, такие как лимфосвет, в течение 25 минут при 800-кратном давлении.

Затем переложите моноядерную фракцию в новую пробирку и долейте ее PBS, содержащей 0,1% объема на объем. Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут при 125-кратном давлении силы тяжести, чтобы истощить раствор тромбоцитов. Затем промойте гранулу PBS, содержащей 0,1% объема на объем BSA, а затем центрифугируйте в течение 10 минут при 800-кратном давлении. Резус суспендирует гранулу в 10 миллилитрах RPMI, содержащей 0,1% объема на объем, БСА помещает клетки в колбу с культурой ткани, обработанной Т 75, и инкубирует в течение одного часа, чтобы обеспечить адгезию моноцитов во фракции.

Затем осторожно удалите надосадочную жидкость, обогащенную лимфоцитами, и гранулируйте клетки при 800-кратном давлении в течение 10 минут. Затем предварительно обрабатывают выделенные лимфоциты с помощью ресусцинации, суспендируя их в растворе RPMI, содержащем 0,1% объема на объем BSA и либо 200 нанограммов на миллилитр антител, блокирующих специфическую функцию коклюшного токсина, либо низкомолекулярных ингибиторов хемокиновых рецепторов. Инкубировать лимфоциты в растворе ингибитора в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, а затем гранулировать клетки и промыть их в PBS с 0,1% объема на объем BSA.

Далее снова гранулируют клетки, а затем повторно суспендируют их в проточной среде в концентрации от одного умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр. Нагрейте прозрачную климатическую камеру с термостатическим контролем до 37 градусов Цельсия. Камера должна содержать отверстия для вставки силиконовых трубок и электронный источник питания электромагнитного клапана.

Наполните стеклянный шприц объемом 50 миллилитров с замком приманки 10 миллилитрами стерильной дистиллированной воды. Затем прикрепите к порту шприца силиконовую трубку длиной 25 сантиметров и вставьте шприц в шприцевой насос. Отрегулируйте скорость забора насоса в соответствии с инструкциями производителя микрослайдов, чтобы поддерживать чистое напряжение 0,05 Паскаля или 0,5 динов на квадратный сантиметр.

Выбросьте плунжеры из двух пятимиллилитровых шприцев и прикрепите цилиндры к двум входным отверстиям электронного электромагнитного клапана с помощью силиконовой трубки в один сантиметр. Затем прикрепите к выпускному клапану 12 сантиметров силиконовую трубку. Вставьте промывочный буфер без ячеек в оба клапана шприца и промойте электронный электромагнитный клапан.

Убедитесь, что буфер течет из одной бочки через клапан в выпускную силиконовую трубку. Затем поверните переключатель клапана на другую бочку и убедитесь, что буфер все еще течет. Удалите все пузырьки из системы.

Затем замените буфер для промывки в одном из бочек на суспензию лимфоцитов, содержащую от одного до 10 до шестого клеток на миллилитр. Подсоедините силиконовую трубку от шприцевого насоса к одному порту выбранного канала микрослайда с помощью адаптера micros slide. Затем подсоедините силиконовую трубку от выпускного клапана к противоположному порту на том же канале микроскольжения также с помощью адаптера микроскольжения.

Затем закрепите микропредметное стекло на предметном столике микроскопа с помощью зажимов или скотча, чтобы предотвратить движение. Перед началом перфузии установите микроскоп на объектив с 10-кратным увеличением и соответствующей настройкой фазы. Убедитесь, что камера правильно прикреплена к микроскопу и готова к передаче изображений на монитор для записи.

Убедитесь, что монослой эндотелия находится в фокусе с помощью шприцевого насоса, перфузируйте эндотелиальный слой бесклеточным промывочным буфером в течение двух минут, начав извлечение шприцевого насоса для удаления любого мусора или несвязанного блокирующего антитела. Затем переключите клапан, чтобы дать пятиминутный болюс раствора лимфоцитов при постоянной стенке. Чистый стресс 0,05 Паскаля в течение последних двух минут болюса лимфоцитов.

Запишите 10 случайных полей по длине микрослайда в течение 10 секунд. Каждое движение между записями должно совершаться против направления потока. Чтобы избежать записи одной и той же роликовой клетки дважды, после болюса лимфоцитов верните клапан в исходное положение, чтобы провести пятиминутный болюс бесклеточного буфера для промывки.

Запишите второй проход из 10 случайно выбранных полей в течение пяти секунд каждое. В течение последних двух минут этого болюса вращательное движение лимфоцитов можно легко визуализировать с помощью этой техники анализа потока. Роликовые ячейки идентифицируются по сниженной скорости на поверхности эндотелия по сравнению с протекающими клетками.

В таком потоке проводится анализ. Менее 10% адгезивных лимфоцитов настойчиво накатывались на стимулированные эндотелиальные клетки, что подтверждает, что анализ потока отражает окружающую среду печеночных синусоид. Запись с болюса промывочного буфера используется для оценки общей адгезии лимфоцитов.

Твердо адгезивные клетки определяются как клетки, которые неподвижны или имеют измененную форму при медленном ползании. Здесь показаны репрезентативные поля с контрольного стекла и предметного стекла, предварительно обработанного молекулой межклеточной адгезии, одним блокирующим антителом. Степень адгезии лимфоцитов в каждом состоянии выражается в адгезивных клетках на квадратный миллиметр на миллион перфузированных клеток.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как конфокальная микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как точный корень трансэндотелиальной миграции или цитоскелетные изменения, которые происходят во время рекрутирования в условиях сильного стресса после его развития. Этот метод проложил путь исследователям, изучающим воспаление в печени или других органах, чтобы изучить, как популяции эндотелиальных клеток, специфичные для органов, управляют процессом набора лейкоцитов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценивать набор лимфоцитов в эндотелиальных клетках печени человека, а также перечислять иммунные клетки на разных стадиях каскада адгезии.