Изображений с плазменным Мембрана Деформации С pTIRFM

Цель данной процедуры — показать, как используется флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения на основе поляризации для изучения ремоделирования мембран во время регулируемого экзоцитоза. Это достигается за счет того, что, во-первых, оптические элементы, а именно четвертьволновая пластина и поляризационные кубы, расположены правильно для генерации дискретных p и s поляризаций возбуждения. Вторым шагом является проверка того, что пучки p и s колина проходят через оптическую ось микроскопа и освещают одну и ту же часть поля зрения при полном внутреннем отражении флуоресценции или TIRF.

Затем клетки, подлежащие визуализации, окрашивают кристаллом из карбоцианида, кристаллом D и стимулируют деполяризующими стимулами для запуска экзоцитоза. Последним шагом является получение изображений сплавления плотных пузырьков ядра во время нахождения в TIRF. В конечном счете, P-T-I-R-F используется для получения изображений в режиме реального времени для мониторинга топологических изменений мембраны, возникающих в результате экзоцитоза хроминовых клеток.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как пирометрия и мембранная емкость, заключается в том, что ptro F сообщает о кривизне мембраны и, как следствие, о расширении термоядерного порта напрямую. Самая крутая часть кривой обучения с помощью этого метода заключается в том, чтобы сначала научиться выравнивать поляризации p и s возбуждения, чтобы они проходили через оптическую ось микроскопа и освещали одну и ту же часть поля изображения. Второй вопрос, который часто возникает, касается окрашивания клеток, а именно, как долго следует подвергать клетки воздействию dd и что представляет собой хорошо окрашенная клетка по сравнению с плохо окрашенной.

Демонстрировать процедуру будет Т.А. Квадратный ряд, аспирант нашей лаборатории. Чтобы начать питание всех компонентов микроскопа, лазеры и компьютеры направляют луч от лазера с яркостью 488 нанометров в заднюю фокальную плоскость линзы с числовой апертурой 1,49. Если лазерный луч сфокусирован на задней фокальной плоскости, он появится, соберется и появится в виде небольшого, четко очерченного пятна на потолке прямо над объективом.

Затем отрегулируйте зеркало Х-гальванометра таким образом, чтобы лазерный луч отклонялся от оси и выходил из объектива под все более крутыми углами к нормалью объектива. Затем убедитесь, что достигнуто полное внутреннее отражение или МДП. Добавьте 10 микролитров флуоресцентных микросфер в один миллилитр объема физиологического раствора и стеклянного дна чашки, должна быть обнаружена только флуоресценция от микросфер на дне чашки, расположенной ближе всего к границе МДП.

Обнаружение плавающих микросфер указывает на то, что угол между падающим светом и нормалью объектива недостаточен. Для получения изображений на основе поляризации используйте выровненный луч 488 нм в качестве ориентира и отрегулируйте положение необработанного лазерного луча 561 нм так, чтобы он шел по идентичному оптическому пути. Лазер с яркостью 561 нанометр будет использоваться для визуализации красителя из карбоцианида.

Расходящаяся линза и зеркала находятся ниже по потоку от 561-нанометрового лазера. С помощью ручек регулировки на зеркалах отрегулируйте луч так, чтобы он совпадал с лучом 488 нанометров, а пятно находилось в фокусе на потолке. Когда зеркала гальванометра находятся в нулевом положении, поляризационный куб отражает вертикальную составляющую электрического поля и проходит горизонтальную составляющую.

Он размещается ниже по потоку эллиптически поляризованного луча на небольшом трансляционном столике. Чтобы облегчить последующее выравнивание поляризации, в лучах используется второй поляризационный куб и зеркала для рекомбинации лучей. Затвор размещается между первым поляризационным кубом и вертикальным компонентным зеркалом.

Второй затвор размещается между горизонтальным компонентным зеркалом и вторым поляризационным кубом. Эти затворы управляются программным обеспечением для обработки изображений, что позволяет пользователю быстро выбирать между поляризациями луча. Используйте поляризационный фильтр для проверки ориентации электрического поля на каждом пути луча.

Поляризационный фильтр обеспечивает пропускание только на одной линии с осью фильтра. Убедитесь, что вертикальная и горизонтальная составляющие лазерного луча выровнены друг с другом и с лучом 488 нанометров, внесите необходимые коррективы. Все три луча должны быть сфокусированы в задней фокальной плоскости и выходить из объектива в одно и то же место на потолке.

Это место может быть помечено крестиком для облегчения выравнивания в будущем. Далее капните каплю погружного масла на объектив. Поставьте в посуду с флуоресцентными микросферами.

На объективе введите МДП, переместив зеркало X-гальванометра в программном обеспечении для перемещения зеркала в TIR. Вертикальная составляющая луча — это S-поляризация, а горизонтальная составляющая луча — это центр P-поляризации, четвертьволновая пластина или qw на пути луча. Непосредственно после лазерной апертуры посмотрите на каждое поляризованное затухающее поле с образцом домина-палочки, который, как предполагается, будет ориентирован случайным образом.

Поверните пластину qw в соответствии со средней интенсивностью пикселей. Выделите здоровые хроминовые клетки из надпочечника кошки, как описано в текстовом протоколе, подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовьте к трансфекции трансфективные клетки с ДНК, кодирующей интересующий белок, с помощью системы электропорации в соответствии с рекомендациями производителя. Настройки, которые обеспечивают наилучший баланс между эффективностью трансфекции и приживаемостью клеток.

Для этого препарат из хромина крупного рогатого скота составляет 1,100 вольт, 40 миллисекунд, и один импульс после трансфекционной пластины клеток аккуратно на поли-делицинах и обработанных коллагеном посудах в одном миллилитре подогретой электропарадной среды. Поместите посуду в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Добавьте один миллилитр двух х антибиотиков в каждую посуду Через шесть часов смените среду на обычную среду на следующий день.

Хроминовые клетки обычно визуализируются через 48 часов или через пять дней после электропорации с помощью системы визуализации на программном обеспечении Start Acquisition. Убедитесь, что лазеры выровнены. Проверьте профиль затухающего поля с помощью микросфер.

Подготовьте глобальную и локальную систему изобилия. Резервуары с раствором очистите отфильтрованной деионизированной водой и заполните базальными и стимулирующими физиологическими солевыми растворами. Перед получением изображения хроминовые клетки проверяют, что P-поляризация и возбуждение S-поляризации освещают одну и ту же область поля зрения и что интенсивности освещения примерно эквивалентны, как описано в текстовом протоколе.

Теперь приступайте к окрашиванию цветных клеток крупного рогатого скота DD. Промойте питательную среду из чашки, содержащей хроминовые клетки, и замените ее двумя миллилитрами базального физиологического раствора. Добавьте 10 микролитров 10 миллимолярного DD непосредственно в чашку, содержащую клетки. Осторожно помешивайте посуду в течение двух-10 секунд, прежде чем удалить раствор.

Вымойте посуду три-четыре раза базальным физиологическим раствором, чтобы удалить остатки DD, теперь клетки окрашены и готовы к использованию. Добавьте каплю иммерсионного масла в объектив. Поместите чашку с окрашенными хроминовыми клетками Dai D поверх объектива.

Расположите местную перфузионную иглу так, чтобы она находилась на расстоянии примерно 100 микрон от клетки. Сфокусируйтесь на клеточной мембране и активируйте аппаратное обеспечение автофокусировки непосредственно перед получением изображения для стимуляции клеток. Начните получение изображения перфузных клеток в течение 10 секунд с базального раствора, а затем в течение 60 секунд с деполяризующего 56 миллимолярного раствора хлорида калия.

Получение изображений при быстром затворе между 561 нм p поляризацией и 561 нм s для мониторинга изменений p и s излучения DD и возбуждения 488 нм. Для визуализации трансфицированного везикулярного зонда обильное мечение хроминовых клеток достигается после короткой инкубации с Dai D.In этом примере клеточная мембрана хорошо окрашивается. Здоровая адгезивная клетка будет демонстрировать явные различия в p- и s-излучении.

На изображении Р-излучения видна более яркая граница ячейки по отношению к остальной части клетки. Изображение S-излучения показывает примерно равномерную флуоресценцию по всей площади клетки, рассчитанную от пикселя к пикселю P по S и p плюс два s. Изображения чувствительны к кривизне мембраны и концентрации красителя соответственно.

Показанные CHRO и клетка также были трансфицированы синапом OIN одним флорином для маркировки секреторных везикул. CHRO и клетка стимулируются хлоридом калия для деполяризации клеточной мембраны и запуска экзоцитоза. Ряд правильно флуоресцентных пятен внезапно становится очевидным, когда плотные пузырьки ядра сливаются.

Белый прямоугольник нарисован вокруг одного события слияния Чтобы проанализировать это событие слияния, были изучены покадровые изменения в одном флорине, po VS и p плюс два s. Флуоресцентная флуоресцентная интенсивность CIT one быстро уменьшается по мере того, как белок диффундирует от места слияния. Вдавливание, представляющее собой комплекс плазматической мембраны сросшихся везикул, уменьшается относительно медленнее.

На этом рисунке показана одна из интерпретаций этих измерений. Быстрая и локализованная деформация мембраны является результатом вызванной раздражителем притока кальция, деполяризация мембраны вызывает значительное увеличение флуоресценции G Camp 5G, что означает повышение уровня субплазматического кальция. Выбирается область ячейки размером 30 на 20 пикселей и кадр за кадром изменяется в лагере G, 5G PS и p плюс два s.

Интенсивность пикселей показана на изображениях и графиках. Умножение на ноль обозначает кадр до того, как изменение PS станет очевидным. Белые стрелки указывают на то, что деформация мембраны сопровождается уменьшением излучения p плюс два S.

Цитозольный белок G CAMP 5G исключен из этой области слитым плотным ядром. Обратите также внимание на внезапное снижение интенсивности G camp 5G в разы до нуля. Долгосрочное увеличение POS и снижение p плюс два s указывает на слияние пор, которое медленно расширяется, как показано на рисунке.

Здесь После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как построить систему PTU F и получить изображение ячеек для наблюдения за топологическими изменениями мембраны в газоне после ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению изменений формы мембраны во время экзоцитоза, эндоцитоза, цитокинеза и подвижности клеток в живых клетках.