Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

Общей целью следующей процедуры является оценка инвазивной способности раковых клеток с помощью трехмерного анализа инвазии. Это достигается путем первого культивирования раковых клеток в матрице базальной мембраны. Затем клеточное вторжение в матрикс наблюдается в течение пяти или более дней с помощью световой микроскопии.

На заключительном этапе клетки помечаются флуоресцентными антителами для локализации интересующих белков. В конечном счете, скорость инвазии раковых клеток и результирующие изменения в экспрессии белка могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как анализ инвазии в камере Transwell, заключается в том, что 3D-анализ основной гелевой инвазии лучше имитирует среду in vivo, которую решает растущий рак.

Применение этого метода заключается в терапии рака, где в ходе исследования могут быть идентифицированы новые белки, которые участвуют в инвазии и метастазировании рака. Перед началом процедуры культивирования поместите матрицу базальной мембраны пипетки P 200 и наконечники пипеток на лед на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день с помощью кончика ледяной пипетки объемом 200 микролитров распределите 50 микролитров матрицы по спирали по дну конфокальной стеклянной нижней чашки номер один.

Затем поместите чашку в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом не менее чем на 30 минут, пока матрица подвергается затвердеванию трипсиновых глаз, 70-80% сливающихся 100-миллиметровых пластин клеток, как только клетки начнут отделяться. Инактивируйте трипсин с помощью 10 миллилитров среды, а затем переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте клетки в течение трех минут при давлении 100 G и четырех градусах Цельсия, пока клетки вращаются вниз.

Добавьте 50 микролитров матрицы в одну миллилитровую микроцентрифужную пробирку на чашку матрицы базальной мембраны и поместите пробирки на лед, когда клетки закончат вращаться. Аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу, а затем восстановите. Подвесьте клетки в одном миллилитре среды и пересчитайте их далее.

Переложите в 2,5 раза по 10 до четвертой клетки в новую микроцентрифужную пробирку, доливая клеточную суспензию со средой до конечного объема 50 микролитров. Затем добавьте 50 микролитров ледяной матрицы базальной мембраны в ячейки в соотношении один к одному, чтобы получить конечный объем в 100 микролитров. Аккуратно нанесите матрикс на клеточную смесь на затвердевшую матрицу базальной мембраны и дайте клеткам встроиться в матрицу в инкубаторе для клеточных культур.

Через 30 минут накройте матрицу двумя миллилитрами среды и поместите чашку обратно в инкубатор, меняя среду каждый день на протяжении всего эксперимента, используйте объектив светового микроскопа 10 раз в день на время эксперимента для снятия 20 дифференциальных интерференций. Контрастные изображения колоний, подвешенных в матрице базальной мембраны. Анализируйте изображения вслепую, чтобы определить образование звездчатой колонии в клетке.

Колония считается звездчатой, если наблюдается один или несколько проекций стероидных клеток. Чтобы изучить морфогенные особенности 3D-колоний, извлеките клетки из инкубатора и поместите их на лоток со льдом. Отсадите среду, а затем трижды промойте колонию двумя миллилитрами холодного ПБС.

После последнего мытья зафиксируйте ячейки в двух миллилитрах 20%-ного ацетона, 80%-ного раствора метанола на 20 минут при четырех градусах Цельсия, а затем снова доведите посуду до комнатной температуры. Как только матрица базальной мембраны достигнет комнатной температуры, аспирируйте фиксатор и трижды промойте пластину PBS, как показано выше. После окончательной промывки заблокируйте любое неспецифическое связывание на клетках двумя миллилитрами 3% БСА не менее чем на 30 минут при комнатной температуре.

Затем инкубируют клетки в первичных антителах, представляющих интерес, разведенных в 3% BSA при комнатной температуре. Через час удалить раствор первичного антитела, трижды смыв несвязанное первичное антитело PBS, добавить вторичное антитело, растворенное в 3% БСА при соответствующем разведении и инкубировать клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. После смывания несвязанного вторичного антитела с помощью PBS окрашивают ядра клеток в два миллилитра гекст 3, 3, 2, 5 8 в PBS на пять минут в темноте.

Затем пять раз смойте несвязанный гекст с ячеек PBS. После пятой промывки добавьте монтажную среду непосредственно на матрицу к клеточной смеси и осторожно накройте монтажную среду стеклянной крышкой, чтобы предотвратить любые нарушения целостности матрицы базальной мембраны к клеточной смеси. Высушите чашку в течение ночи при комнатной температуре, затем получите изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими длинами волн лазера для антител, используемых на этих изображениях.

Проиллюстрированы MDA MB 2 3 1 клетки, вторгающиеся в 3D матрицу. Клетки встраивались в матрицу в первый день и начали формировать инвазивные звездчатые структуры к третьему дню. К пятому дню можно было наблюдать полное вторжение матрицы.

Затем подсчитывалось количество образовавшихся колоний звездчатых пород, которое выражалось в процентах от общего числа инвазивных и неинвазивных колоний на одну чашку. Кроме того, поскольку измерения проводились ежедневно в течение пяти дней, скорость инвазии также можно было оценить на этих иммунофлуоресцентных изображениях. Репрезентативные инвазивные звездчатые колонии клеток MDA MB 2 3 1, демонстрирующие потерю целостности мембраны и диффузную локализацию белка ламинина 5 базальной мембраны, резко контрастируют с тем, что наблюдается в клетках рака молочной железы MDA MB 2 31.

Пятый ламинин был локализован в неповрежденном слое базальной мембраны, содержащем азинин памяти необработанных незлокачественных клеток MCF 10 A. После этой процедуры может быть проведена кокультура со стромальными клетками, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как перекрестное взаимодействие раковых клеток со стромальными клетками в микроокружении после их развития. Этот метод проложил путь исследователям в области онкологии к изучению инвазии и миграции рака, которые необходимы для метастатического распространения раковых клеток.