Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

Общая цель следующей процедуры заключается в оценке инвазивной способности раковых клеток с помощью трехмерного теста на инвазию. Это достигается путем первоначального культивирования раковых клеток в матриксе базальной мембраны. Затем инвазия клеток в матрикс наблюдается в течение пяти или более дней с помощью световой микроскопии.

На заключительном этапе клетки маркируют флуоресцентными антителами для локализации интересующих белков. В конечном итоге с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии можно проанализировать скорость инвазии раковых клеток и результирующие изменения в экспрессии белков. Основным преимуществом данного метода перед существующими методиками, такими как анализ инвазии в камерах Transwell, является то, что анализ инвазии в 3D-матриксном геле лучше имитирует условия in vivo, в которых растут раковые клетки.

Данный метод может быть применен в терапии рака, что позволит выявлять новые белки, участвующие в инвазии и метастазировании опухолей. Перед началом процедуры культивирования поместите матрикс базиментальной мембраны, дозатор P 200 и наконечники для дозатора на лед в холодильник при температуре 4 °C на ночь. На следующий день с помощью охлажденного наконечника дозатора объемом 200 µL нанесите 50 µL матрикса спиралевидными движениями на дно стеклянного планшета для конфокальной микроскопии (номер 1).

Затем поместите чашку в инкубатор для культур клеток при 37 °C с 5% CO2 минимум на 30 минут до затвердевания матрицы. Добавьте трипсин на 100-миллиметровую чашку с клетками при их конфлюэнтности 70–80%, когда клетки начнут открепляться. Инактивируйте трипсин с помощью 10 мл среды, после чего перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки в течение трех минут при 100 G и 4 °C до осаждения клеток.

Распределите по 50 µL матрицы в микроцентрифужные пробирки объемом 1 мл для каждого блюда с матриксом базиментальной мембраны и поместите пробирки на лед после завершения центрифугирования клеток. Аспирируйте супернатант, не затрагивая осадок, а затем ресуспендируйте клетки в 1 мл среды и проведите их подсчет.

Перенесите 2,5 × 10⁴ клеток в новую микроцентрифужную пробирку, долив среду в клеточную суспензию до конечного объема 50 µL. Затем добавьте к клеткам 50 µL ледяного матрикса базимента мембраны в соотношении один к одному, чтобы конечный объем составил 100 µL. Осторожно нанесите смесь матрикса и клеток на затвердевший матрикс базимента мембраны и оставьте клетки в инкубаторе для культивирования клеток до полного встраивания в матрикс.

Через 30 минут залейте матрикс двумя миллилитрами среды и верните чашку в инкубатор, ежедневно заменяя среду на протяжении всего эксперимента. Один раз в день в течение всего эксперимента используйте объектив 10x светового микроскопа для получения 20 изображений колоний, суспендированных в матриксе базальной мембраны, методом дифференциально-интерференционного контраста. Проведите слепой анализ изображений для определения степени формирования звездчатых структур клеточных колоний.

Колония считается звездчатой, если наблюдаются один или несколько выступов из стероида клеток. Чтобы изучить морфогенетические особенности 3D-колоний, извлеките клетки из инкубатора и поместите их на подложку со льдом. Аспирируйте среду, а затем трижды промойте колонию двумя миллилитрами холодного PBS.

После последнего промывания зафиксируйте клетки в двух миллилитрах раствора 20% acetone и 80% methanol в течение 20 минут при температуре four degrees Celsius, после чего доведите чашки до комнатной температуры. Когда матрикс базальной мембраны достигнет комнатной температуры, аспирируйте фиксатор и промойте планшет трижды с помощью PBS, как было показано ранее. После финального промывания заблокируйте неспецифическое связывание на клетках, добавив два миллилитра 3% BSA, и выдержите в течение не менее 30 минут при комнатной температуре.

Затем инкубируйте клетки с необходимыми первичными антителами, разведенными в 3% BSA, при комнатной температуре. Через час удалите раствор первичных антител, трижды промыв образец PBS для удаления несвязавшихся антител, затем добавьте вторичные антитела, растворенные в 3% BSA в соответствующем разведении, и инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. После удаления несвязавшихся вторичных антител с помощью PBS окрасьте ядра клеток в двух миллилитрах hext 3, 3, 2, 5 8 в PBS в течение пяти минут в темноте.

Затем пять раз промойте клетки раствором PBS, чтобы удалить несвязавшийся гекст. После пятой промывки нанесите среду для заключения непосредственно на смесь матрикса и клеток и осторожно накройте ее предметным стеклом, чтобы не нарушить целостность смеси матрикса базальной мембраны и клеток. Оставьте чашку сохнуть на ночь при комнатной температуре, после чего получите изображения с помощью флуоресцентного микроскопа, используя длины волн лазера, соответствующие антителам, примененным в данных изображениях.

Продемонстрированы клетки MDA MB 2 3 1, инвазирующие 3D-матрикс. Клетки были внедрены в матрикс в первый день и начали формировать инвазивные звездчатые структуры к третьему дню. К пятому дню наблюдалась полная инвазия матрикса.

Затем подсчитали количество образовавшихся звездчатых колоний и выразили его в процентах от общего числа инвазивных и неинвазивных колоний на одну чашку. Кроме того, поскольку измерения проводились ежедневно в течение пяти дней, по этим иммунофлуоресцентным изображениям можно было оценить скорость инвазии. Репрезентативные инвазивные звездчатые колонии клеток MDA MB 2 3 1, характеризующиеся потерей целостности мембран и диффузной локализацией белка базальной мембраны ламинина пять, представлены в резком контрасте с тем, что наблюдается в клетках рака молочной железы MDA MB 2 31.

Ламинин 5 локализовался в интактном слое базальной мембраны, окружающем клеточную массу необработанных незлокачественных клеток MCF 10 A. После завершения этой процедуры можно провести совместное культивирование со стромальными клетками, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, взаимодействуют ли раковые клетки со стромальными клетками в микроокружении после его формирования. Данная методика открыла перед исследователями в области онкологии возможности для изучения инвазии и миграции раковых клеток, обе из которых необходимы для метастатического распространения опухоли.