Гликопептиды Захват для клеточной поверхности протеомики

Общая цель этой процедуры заключается в обогащении белков клеточной поверхности с низким содержанием в большом количестве. Это достигается путем предварительной денатурации и расщепления мембранных белков. Второй шаг заключается в окислении гликанов и захвате гликозилированных пептидов на поверхности смолы.

Затем негликопептиды смываются со смолы. Последним этапом является высвобождение N-связанных гликопептидов из смолы для анализа lc MS. В конечном счете, идентифицированная пептидная последовательность может быть сопоставлена с белками для целей идентификации и количественной оценки.

Сегодня я покажу вам, как работает пептидный захват ral от Geico. Основное преимущество этой методики передозировки, например, таких как захват гликопротеина, заключается в том, что мембранный белок сначала будет переварен и захват гликопептида может быть осуществлен в одном сосуде. Применение этой методики может быть расширено до открытия биомаркера заболевания.

Поскольку белок аллигатора может выделяться с кровью и другими жидкостями организма, а также циркулирующий гликопротеин в крови, которые специфичны для патологического процесса, могут быть использованы в качестве биомаркеров прогноза и диагностики. Сначала приготовьте четыре миллилитра гипотонического буфера с коктейлем ингибиторов протеазы от одного до 100. Добавьте один миллилитр гипотонического буфера в клеточную гранулу, содержащую примерно от 10 до восьми клеток, и инкубируйте смесь в течение 15-30 минут.

Затем с помощью гемоцитометра проводят окрашивание триановым синим. Чтобы проверить эффективность лизиса, соедините один миллилитр лизата с тремя миллилитрами оставшегося гипотонического буфера. Вращайте трубку при температуре 3000 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Переложите супернадосадочную жидкость в ультрацентрифужную пробирку и храните гранулы в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия. Вращайте ультрацентрифужную пробирку при температуре 100 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение двух часов. Далее растворите микросомальную фракцию в 200 микролитрах денатурационного буфера, а затем прокипятите раствор при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Охладив нагретый раствор до комнатной температуры, добавьте порошок мочевины сверхвысокой чистоты, чтобы получить конечную концентрацию в восемь моляров, и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации добавьте 500 миллимоляров. В исходный раствор ацетамида к образцу дают конечную концентрацию 15 миллимоляров.

Затем инкубируйте раствор в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы алкилировать свободные тиолы в образце. После этого добавьте в образец один молярный стоковый раствор DTT для получения конечной концентрации 10 миллимоляров и инкубируйте раствор еще 10 минут при комнатной температуре. Для гашения избытка I oto ацетамида разбавляют полученный раствор в 10 раз 40 миллимолярным трис-буфером при PH 8, а затем добавляют в образец трипсин в соотношении один к 20 к общему количеству белка.

Получите количество общего белка с помощью анализа Брэдфорда. Поддерживайте реакцию пищеварения в духовке при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы убедиться, что реакция завершена. Когда закончите, завершите разложение, подкислив раствор образца до pH 1 10 миллимолярной соляной кислотой, условие, которое также ухудшается быстрее всего.

Затем моющее средство разлагается наиболее быстро при 37 градусах Цельсия в течение одного часа в инкубаторе. После инкубации образовавшийся осадок удалить центрифугированием после центрифугирования. Очистите SUP natin, содержащий пептиды образца, картриджем для твердофазной экстракции C 18 и высушите полученный образец с помощью скоростного вакуума.

Проведите анализ образцов до и после поездок и сбраживания с помощью паспорта безопасности, чтобы подтвердить эффективность сбраживания. На этом этапе растворите очищенные пептиды в 200 микролитрах буфера для связывания. После добавления в раствор пептида очистки натрия получить конечную концентрацию 10 миллимоляров.

Инкубируйте образец в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре Когда инкубация завершена, утолите избыток прата сульфитом натрия до конечной концентрации 20 миллимоляров и pH пяти после инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре, введите в пептидный раствор 200 микролитров раствора смолы, предварительно уравновешенного и связывающего буфера. Инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух дней с вращением встык для полного соединения. Когда закончите, удалите несвязанные пептиды, дважды промыв смолу одним миллилитром деионизированной воды, одним миллилитром 1,5 молярного хлорида натрия, одним миллилитром метанола и одним миллилитром 80% ацетонитрила.

Далее соберите надосадочную жидкость и смывки для анализа на несвязанные пептиды. Храните образцы в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа. Затем промойте смолу три раза одним миллилитром 100 миллимолярного бикарбоната аммония при pH восемь.

Наконец, добавьте 300 микролитров бикарбоната аммония во флакон с образцом. Для высвобождения N гликопептидов из смолы. Добавьте PNG ACE F и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия с вращением из конца в конец.

После этого соберите высвободившиеся пептиды методом центрифугирования, после чего промойте смолу одним миллилитром 80% ацетилнитрила. Соедините смывку с ранее собранной. Окончательно высушите полученный раствор при скорости VAC для lc MS анализа.

В полученном гликопептиде показан атипичный спектр гликопептида, полученный после метода обогащения. N-гликан удаляли, а присоединенный к нему пренебрежительный гликан превращали в спартиновую кислоту с помощью P-N-G-A-F. Таким образом, спектр может быть легко найден любой протеомной поисковой системой по общим базам данных белковых последовательностей.

Атипичный lc MS. Здесь показан результат захвата n гликопептидов, в котором более 100 гликопротеинов могут быть идентифицированы из одного прогона lc MS микросомальной фракции клетки. Селективность обогащения как к гликопротеинам, так и к гликопептидам обычно составляет более 90%. Успешный анализ может иметь селективность обогащения 95% с использованием колонки SCX и ступенчатого градиента для дальнейшего фракционирования. В образцах, предшествующих анализу LCMS, обычно удваивается количество идентификаций гликопротеинов.

Иногда, когда количество полученных гликопептидов невелико, в конечном образце может наблюдаться примесь, накопленная из флаконов. Эти загрязнения можно удалить с помощью колонки MCX. Итак, после просмотра этого видео, я надеюсь, вы хорошо понимаете, как использовать наши методы захвата гликопептидов для изучения мембранного белка самообслуживания.

При использовании этого протокола также важно выделить образцы для каждого шага для устранения неполадок. Объем реагента также может быть оптимизирован для вашего конкретного исследования.