Гликопептиды Захват для клеточной поверхности протеомики

Общая цель данной процедуры заключается в обогащении мембранных белков клеточной поверхности с низкой концентрацией. Это достигается путем предварительной денатурации и переваривания мембранных белков. На втором этапе проводится окисление гликанов и захват гликозилированных пептидов на поверхности смолы.

Затем негликопептиды вымывают из смолы. Заключительным этапом является высвобождение N-гликопептидов из смолы для анализа методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (lc MS). В конечном итоге идентифицированная пептидная последовательность может быть соотнесена с белками для целей идентификации и количественного анализа.

Сегодня я продемонстрирую вам принцип работы метода захвата гликопептидов Geico. Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими, такими как захват гликопротеинов, заключается в том, что мембранный белок сначала подвергается перевариванию, после чего захват гликопептида может быть осуществлен в одной пробирке. Применение данного метода может способствовать поиску биомаркеров заболеваний.

Поскольку белок gator может выделяться в кровь и другие биологические жидкости организма, а циркулирующие в крови гликопротеины, специфичные для патологического процесса, могут быть использованы в качестве прогностических и диагностических биомаркеров, первым шагом необходимо приготовить 4 мл гипотонического буфера с добавлением коктейля ингибиторов протеаз в соотношении 1:100. Добавьте 1 мл гипотонического буфера к клеточному осадку, содержащему примерно 10⁸ клеток, и инкубируйте смесь от 15 до 30 минут на льду, затем перенесите клетки в пробирку объемом 2 мл и проведите лизис клеток, пропустив образец через иглу шприца от 5 до 10 раз.

Затем используйте гемоцитометр и окрашивание трипановым синим. Чтобы проверить эффективность лизиса, смешайте 1 mL лизата с 3 mL оставшегося гипотонического буфера. Центрифугируйте пробирку при 3000 ×g при температуре 4 °C в течение 15 минут.

Перенесите супернатант в пробирку для ультрацентрифугирования, а осадок поместите на хранение в морозильную камеру при температуре -80 °C. Центрифугируйте пробирку при 100,000 ×g при температуре 4 °C в течение двух часов. Затем растворите микросомальную фракцию в 200 µL денатурирующего буфера и прокипятите раствор при 100 °C в течение 10 минут.

После охлаждения нагретого раствора до комнатной температуры добавьте порошок мочевины сверхвысокой чистоты до достижения конечной концентрации 8 M и инкубируйте образец при 37 °C в течение 30 минут. После инкубации добавьте в образец стоковый раствор иотоацетамида 500 мM до достижения конечной концентрации 15 мM.

Затем инкубируйте раствор в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре для алкилирования свободных тиолов в образце. После этого добавьте в образец стоковый раствор DTT в концентрации 1 M до конечной концентрации 10 mM и инкубируйте раствор еще 10 минут при комнатной температуре. Чтобы нейтрализовать избыток иотоацетамида, разбавьте полученный раствор в 10 раз 40 mM Трис-буфером при pH 8, а затем добавьте в образец трипсин в соотношении 1:20 по отношению к общему количеству белка.

Определите общее количество белка с помощью метода Брэдфорда. Оставьте реакционную смесь для переваривания в термостате при 37 °C на ночь, чтобы обеспечить полноту протекания реакции. По завершении прекратите процесс переваривания, доведя pH раствора образца до одного путем добавления 10 мM соляной кислоты; в этих условиях также происходит деградация rapidest.

Затем моющее средство подвергают разложению при 37 °C в течение одного часа в инкубаторе. После инкубации выпавший осадок удаляют путем центрифугирования. Супернатант, содержащий пептиды образца, очищают с помощью картриджа для твердофазной экстракции C 18, а полученный образец высушивают в вакуум-концентраторе.

Проведите анализ образцов до и после обработки и переваривания с помощью SDS-PAGE для подтверждения эффективности переваривания. На этом этапе растворите очищенные пептиды в 200 µL буфера для сшивания. После этого добавьте пуриат натрия в раствор пептидов до достижения конечной концентрации 10 mM.

Инкубируйте образец в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. По завершении инкубации погасите избыток прата сульфитом натрия до конечной концентрации 20 millimolar и pH 5. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре добавьте в раствор пептида 200 microliters раствора смолы с производным гидроцита, предварительно уравновешенного буфером для связывания. Инкубируйте реакционную смесь при 37 degrees Celsius от одного до двух дней при постоянном вращении для полного связывания. По окончании удалите несвязанные пептиды, промыв смолу дважды одним миллилитром деионизированной воды, одним миллилитром 1.5 molar хлорида натрия, одним миллилитром метанола и одним миллилитром 80% ацетонитрила.

Затем соберите супернатант и промывочные растворы для анализа несвязавшихся пептидов. Храните образцы в морозильной камере при температуре -80 °C до проведения анализа. После этого промойте смолу три раза 1 мл 100 мМ бикарбоната аммония при pH 8.

Наконец, добавьте 300 µL бикарбоната аммония в пробирку с образцом. Для высвобождения N-гликопептидов из смолы добавьте PNGase F и инкубируйте образец при 37 °C в режиме конце-в-конец.

После этого соберите высвобожденные пептиды путем центрифугирования, затем промойте смолу одним миллилитром 80% ацетонитрила. Объедините промывочную жидкость с ранее собранными фракциями. В завершение высушите полученный раствор в вакуум-концентраторе SpeedVac для последующего анализа методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS).

Здесь представлен нетипичный спектр гликопептида, полученный после применения метода обогащения. N-гликан был удален, а место прикрепления гликана было преобразовано в аспарагиновую кислоту с помощью P-N-G-A-F. Таким образом, спектр может быть легко проанализирован любым протеомным поисковым движком по общедоступным базам данных белковых последовательностей.

Атипичный жидкостный хромато-масс-спектрометрический (ЖХ-МС) анализ. Здесь представлены результаты анализа выделенных N-гликопептидов, при которых более 100 гликопротеинов могут быть идентифицированы за один запуск ЖХ-МС фракции микросом клеток. Селективность обогащения как гликопротеинами, так и гликопептидами обычно превышает 90%. При использовании колонки SCX и ступенчатого градиента для дальнейшего фракционирования успешный анализ может обеспечить селективность обогащения на уровне 95%. Обработка образцов перед ЖХ-МС анализом обычно позволяет удвоить количество идентифицированных гликопротеинов.

Иногда, когда количество полученных гликопептидов невелико, в конечном образце могут наблюдаться примеси, накопившиеся из флаконов. Эти загрязнения можно удалить с помощью колонки MCX. Таким образом, после просмотра этого видео, надеюсь, вы получили четкое представление о том, как использовать наши методы захвата гликопептидов для изучения мембранных белков.

При выполнении данного протокола также важно отбирать контрольные образцы на каждом этапе для последующего поиска и устранения ошибок. Объем реагента также может быть оптимизирован под конкретные задачи вашего исследования.