Лазерно-индуцированное Разбивка спектроскопия: новый подход по картированию и количественной наночастиц в ткани органа

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы предложить простой и надежный метод картирования и количественного определения органических и неорганических элементов в биологической ткани с использованием настольного оборудования, полностью совместимого с обычной световой микроскопией. Это достигается путем фокусировки лазерного импульса на исследуемом образце для инициирования пробоя и искрения материала. Плазма излучает свет, который в дальнейшем анализируется с помощью спектрометра.

Вторым этапом является выбор и идентификация спектральных линий, соответствующих интересующим элементам, и сканирование поверхности образца. Затем выполняют калибровочные измерения для определения концентраций элементов. Заключительный этап заключается в построении карты распределения элементов в ткани образца на основе всех зарегистрированных спектров с использованием шкалы относительной интенсивности или концентрации.

В конечном счете, спектроскопия лазерно-индуцированного пробоя используется для демонстрации распределения различных элементов в тканях без какого-либо мечения. По сравнению с другими существующими методами, такими как микрорентгенофлуоресцентный анализ или методы на основе масс-спектрометрии, спектроскопия лазерно-индуцированного пробоя (LIBS) проста в реализации, работает при атмосферном давлении и совместима с большинством систем оптической микроскопии.

Кроме того, данный метод позволяет достичь чувствительности на уровне PPM при разрешении порядка микрона. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос нанотехнологий в приложении к биологическим исследованиям, например, определить распределение в образце ткани наночастиц, содержащих металлический элемент, без необходимости маркировки наночастиц. Техника может быть применена в патологии благодаря низкому пределу обнаружения аномальных содержаний металлических элементов, таких как медь, железо и алюминий, которые могут присутствовать в различных органах тела, особенно в головном мозге. Таким образом, данный метод позволяет получить представление об обнаружении и идентификации наночастиц.

Данный метод также может быть применен к другим системам, таким как обнаружение неорганических элементов в TCU или исследование гетерогенного распределения элементов. Ученым, проводящим подобные эксперименты, придется оптимизировать настройки сбора данных, чтобы получить максимально возможный сигнал, не допуская при этом чрезмерного повреждения образцов. Начните эксперимент с подготовки предметных стекол с образцами для исследования в соответствии с данным протоколом.

Извлеките органы мышей с опухолями, которым ввели раствор наночастиц гадолиния, для подготовки препаратов. Поместите срезы органов толщиной 100 µm на кварцевое предметное стекло или в чашку Петри. Всегда храните стекла при температуре -80 °C.

Затем подготовьте образцы для калибровки. Маркируйте несколько пробирок, указав на них концентрации, начиная от 0 nanomolar и заканчивая 5 millimolar. В каждую пробирку внесите по 100 µL смеси гадолиния в воде с соответствующей концентрацией.

После завершения этого этапа подготовьте предметное стекло. Отмерьте 5 µL из первого флакона и нанесите каплю на кварцевое стекло или в чашку Петри. Обязательно промаркируйте каплю для последующего использования.

Переместитесь на три миллиметра вдоль окружности и нанесите пять µL раствора следующей концентрации на предметное стекло. Повторите это действие для каждого из оставшихся растворов. Высушите содержимое предметного стекла в течение 20 минут при комнатной температуре.

В данной установке используется наносекундный лазер на алюмо-иттриевом гранате с неодимом, генерирующий луч с длиной волны 1064 нанометров. Часть луча используется для синхронизации системы спектрометра. Другая часть направляется через управляемый компьютером аттенюатор, который служит для регулировки и стабилизации энергии лазерного импульса на протяжении всего эксперимента.

Затем направьте пучок в область образца. Сфокусируйте пучок на управляемом программно столике перемещения. На нем будет закреплен держатель образца, а одна CCD-камера будет использоваться для мониторинга поверхности крепления образца.

Другой используется для мониторинга плазменного факела. Анализ света от пробоя образца проводится с помощью спектрометра с поворотной решеткой и ICCD-камерой, поддерживаемой при температуре -26 °C. Для проведения измерения начните стабилизацию лазера и охлаждение камеры до -26 °C.

За 10 минут до начала эксперимента. Когда будете готовы, с помощью аттенюатора зафиксируйте энергию импульса на уровне 5 мДж. Затем возьмите предметное стекло с образцом для исследования и подготовьтесь к его установке на предметный столик.

Закрепите образец в моторизованном держателе для образцов. После этого вернитесь к компьютеру. Чтобы позиционировать образец, переместите предметный столик так, чтобы часть образца находилась в луче лазера.

Отрегулируйте фокус лазера примерно на 100 micrometers ниже поверхности образца. При такой настройке лазер образует кратеры размером 50 micrometers или менее. С помощью компьютера установите ширину входной щели спектрометра на 40 micrometers и настройте параметры ICCD для проведения картирования.

Отрегулируйте положение держателя, чтобы выбрать целевую область образца. Сделайте панорамный снимок образца с высоким разрешением, используя источник света с широким спектром. Затем с помощью программного обеспечения и полученного изображения определите область сканирования и разрешение LIBS.

В данном случае сетка составляет 100 на 100 точек с шагом 100 µm между ними. Запустите автоматический сбор данных в каждой точке сетки. Спектр измеряется и записывается в файл.

Когда измерения будут завершены (примерно через 30 минут), сделайте второй снимок среза образца, затем объедините все спектры в один файл данных для последующего использования. Далее извлеките предметное стекло с образцом и подготовьтесь к установке калибровочных образцов. Закрепите кварцевое стекло с калибровочными образцами на столике перемещения, возвращаясь к компьютеру.

Поместите центр первого калибровочного образца на пути лазерного луча. Сохраните параметры эксперимента и запишите спектр. Повторите эти действия для каждого образца с различной концентрацией гадолиния.

На данных примерах представлены однократные спектры, записанные в разных областях ткани почки. Синий спектр был записан в центральной области почки. Красный спектр соответствует мембране почки, а зеленый спектр — периферической области.

Введенные наночастицы на основе гадолиния состоят из полислановой матрицы с ионами гадолиния, хелатированными лигандом DOTA на их поверхности. В используемом спектральном диапазоне от 286 nm до 320 nm может быть обнаружено присутствие гадолиния, кальция, железа, кремния и алюминия. Обратите внимание, как интенсивность сигналов варьируется в различных областях образца, что указывает на значительную гетерогенность концентраций этих элементов; картирование распределения гадолиния, кремния и железа в срезе почки мыши было выполнено с использованием данных LIBS с разрешением около 100 µm.

Интенсивность шкалы выражена в произвольных единицах. Это изображение в естественном свете. Для сравнения: аналогичные результаты были получены с образцами опухоли.

Как и в случае с этой картой распределения гадолиния в тканях опухоли SQ 20 B, на изображение в естественном свете была наложена ложная цветовая шкала. В данном эксперименте наночастицы вводились непосредственно в опухоль. Через один час опухоль была удалена и подготовлена к анализу.

Обратите внимание, что примерно половина объема опухоли содержит частицы. Эта методика может быть выполнена менее чем за один час для образцов площадью один квадратный сантиметр с разрешением 100 micrometer при условии ее правильного проведения. При выполнении LIBS важно помнить, что измерения проводятся по лазерно-индуцированной плазме, и крайне важно контролировать все параметры на протяжении всего эксперимента в соответствии с данной процедурой.

Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о типе клеток, задействованных в изучаемом процессе после его развития, могут быть применены другие методы, такие как иммуногистохимия на соседних срезах. Данная методика открывает исследователям в области нанотехнологий, применяемых в биологии и медицине, возможность изучать распределение соединений, содержащих металлические элементы, в биологических тканях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать методы LA-ICP-MS для картирования нескольких элементов в биологических тканях.