Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Общей целью этой процедуры является изучение метаболического профилирования в культивируемых клетках. Это достигается путем предварительного извлечения полярных метаболитов из клеток. Второй шаг заключается в восстановлении клеточных экстрактов в воде и переносе образцов в флаконы с LC.

Затем образцы вводятся в прибор lc QE MS, который был откалиброван, и на заключительном этапе необработанные данные записываются в компьютер. Метаболитные пики извлекаются из исходных данных с помощью коммерческого программного обеспечения, а неизвестные пики ищутся в массовой базе данных с высоким разрешением. Хотя этот мастер может дать представление об относительных уровнях метаболитов в SARS, его также можно применять к другим системам, таким как сыворотка или ткани.

Сначала приготовьте 500 миллилитров подвижной фазы А, которая представляет собой 20 миллимоляр ацетата аммония, и 15 миллимолярного гидроксида аммония в 3% ацето, нитриле и воде. Неплотно укупорив флакон, протокайте раствор на водяной бане в течение 10 минут без нагревания. После этого растворите пять миллиграммов как фторацетата натрия, так и кислоты в пяти миллилитрах воды, чтобы получить конечную концентрацию в один миллиграмм на миллилитр.

Затем растворите диазинон в метаноле, чтобы получить конечную концентрацию 10 микрограмм на миллилитр. Для приготовления одного миллилитра отрицательного низкомассового калибровочного раствора смешайте 960 микролитров термоотрицательного калибровочного раствора с 20 микролитрами раствора фторацетата натрия и гомованилиновой кислоты. Для приготовления одного миллилитра положительного низкомассового калибровочного раствора смешайте 990 микролитров термоположительного калибровочного раствора и 10 микролитров раствора диазинона.

После проведения стандартной калибровки массы в положительном режиме отрегулируйте диапазон сканирования до 60 до 900 отношение массы к заряду на панели управления прибора и примените индуцированную столкновением источника диссоциацию на 25 электронвольт. Введите настраиваемые калибровочные ионы, и как только источник ионов станет стабильным, запустите индивидуальную калибровку на странице настройки. Переключите полярность в отрицательный режим после проведения стандартной калибровки массы в отрицательном режиме, отрегулируйте диапазон сканирования до 60-900 отношения массы к заряду на панели управления прибора и примените диссоциацию, вызванную столкновением источника, на 35 электронвольт.

Введите настраиваемые калибровочные ионы, и как только источник ионов станет стабильным, начните индивидуальную калибровку. На странице настройки оснастите прибор QE MS нагретым зондом для ионизации электрораспылением или зондом HESI, закрепив его на уровне C, а затем подключив к входным отверстиям газообразного азота, кабелю испарителя и кабелям напряжения. На странице настройки компьютера задайте соответствующие параметры настройки для пробника.

Установите температуру капилляров на 320 градусов Цельсия, а S линзу на 55. Далее в программе метода постройте метод полного сканирования, используя следующие значения. Определите метод хроматографии путем ввода информации о линейном градиенте.

Используйте среднюю колонну для разделения компаунда при комнатной температуре. На этом этапе приготовьте экстракционный растворитель, вручную смешав 40 миллилитров метанола и 10 миллилитров воды в 50 миллилитре. Два. При ранее культивированном раке толстой кишки H CT восемь клеток достигают 80% конфлюенции.

Быстро отсадите среду и поместите шестилуночную пластину поверх сухого льда. Затем сразу же добавьте по одному миллилитру растворителя для экстракции в каждую лунку и переложите пластину в морозильную камеру с отрицательным температурой 80 градусов по Цельсию. Вынув тарелку из морозильной камеры, через 15 минут поместите ее поверх сухого льда и соскребите ячейки в растворитель.

Перелейте раствор из каждой лунки в три пробирки эйнора объемом 1,7 миллилитра и центрифугируйте образцы со скоростью 20 000 G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. После центрифугирования перенесите надосадочную жидкость в две новые эйноровые пробирки. Затем высушите образцы в скоростном вакууме.

Как только образцы высохнут, храните их в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия. После извлечения образцов из морозильной камеры для анализа дайте им нагреться до ледяной температуры. Затем добавьте 20 микролитров ледяной воды и перебейте образцы в вихрь, чтобы растворить метаболиты.

Затем центрифугируйте образцы при температуре 20 000 G при четырех градусах Цельсия. В течение двух минут переложите SUPERNAT в lc флаконы и введите пять микролитров образцов в прибор lc QES для анализа. После того, как калибровка была правильно выполнена на приборе QE MS, уравновесьте колонку LC в течение пяти минут 85% подвижной фазы B со скоростью потока 0,15 миллилитров в минуту.

Затем настройте последовательность образцов в случайном порядке, чтобы распределить колебания, вносимые LCMS в каждую выборку, и обеспечить более точное сравнение между различными образцами. После каждых шести проб добавляйте промывочный прогон, а затем чистый образец для оценки фона системы и уровней перехода. Сохраните последовательность и запустите ее выполнение.

После того, как колонка lc покажет стабильное давление, близкое к 400 фунтам на квадратный дюйм, после того, как первые два образца последовательности будут обработаны, проверьте пики на этих хроматограммах на наличие неизвестных метаболитов, чтобы убедиться, что последовательность образцов работает гладко. После того, как все образцы в последовательности будут готовы, выполните анализ данных на отдельном компьютере. Выберите метод выравнивания пиков и выделения кадра для малых молекул в коммерчески доступном программном обеспечении.

Затем загрузите необработанные данные lc ms и сгруппируйте их по типам выборок. Выберите образцы в середине последовательности прогона в качестве эталонного образца хроматографии для выравнивания пиков и выберите группу в качестве группы отношений или вычисления полного изменения. Затем загрузите исходное значение кадра, включая известные метаболиты для целевого анализа метаболитов с собранными данными и соответствующим начальным значением кадра.

Затем выберите полное сканирование спектров в положительном или отрицательном режиме и сохраните этот файл обработки данных в той же папке, что и исходные данные. Отключите функцию поиска по базе данных и запустите рабочий процесс. Затем экспортируйте данные процесса в виде листа Excel, содержащего пиковую область каждого кадра.

Для анализа нецелевых метаболитов выберите метод экстракции компонентов. Загрузите образец исходных данных и три пустых образца для вычитания фона. Вслед за этой группой, исходные данные и устанавливаем эталонные выборки, как описано ранее.

Установите пороговое значение компонента на 10 к пятому. Используйте базу данных метаболомов человека для идентификации неизвестных соединений. После сохранения этого файла обработки отключите функцию поиска в базе данных и запустите рабочий процесс.

После завершения обработки данных используйте коэффициенты вариации или фильтры CV для удаления компонентов с большим CV в повторяющихся образцах и фильтрах интенсивности. Чтобы удалить компоненты, обнаруженные на уровне шума, вручную пройдитесь по каждому компоненту и выберите те, у которых четко выраженный пик или относительно большая разница в разных типах выборок для поиска в базе данных. Наконец, экспортируйте данные с обращениями в базу данных.

Точность данных метаболомики в значительной степени зависит от производительности прибора lc QEMS для оценки того, работает ли прибор в хорошем состоянии и является ли применяемый метод правильным. Несколько известных пиков метаболитов lc выделены из общей ионной хроматографии, как показано здесь. Полярные метаболиты, включая аминокислоты, гликолиз, промежуточные продукты, ТСА, промежуточные нуклеотиды, витамины А, ТП и НАДФ, имеют хорошую удерживаемость на столбике и хорошие формы пиков в современных условиях ЛЦ.

Между тем, испытание на погрешность массы проводится в течение 24 часов после калибровки с низкой массой, как показано на рисунке. Здесь погрешность массы оценивается путем сравнения обнаруженного отношения массы к заряду с теоретическим отношением массы к заряду целевых метаболитов. При этом целевые метаболиты имеют отношение массы к заряду в диапазоне от 74 до 744.

Ось Y здесь представляет собой накопленный процент метаболитов в определенном диапазоне погрешностей массы. Синяя кривая показывает результат от нуля до 12 часов, а красная цветная кривая показывает данные, собранные за период от 12 до 24 часов после калибровки. Более 90% метаболитов находятся в пределах пяти частей на миллион массовой ошибки, что означает, что разработанный здесь метод калибровки малого диапазона масс достаточен для поддержания погрешности в пять частей на миллион для обнаружения малого массового диапазона.

Еще одна проблема, которую необходимо решить, — это чувствительность прибора при текущем методе и настройке прибора. Серийное разбавление тройных проб из 10-сантиметровой чашки Петри проводилось пять раз с коэффициентом разбавления 6, что приводило к шести различным концентрациям проб. Целевой список используется для оценки количества метаболитов, обнаруженных при различных концентрациях образца.

Показанные здесь результаты показывают, что оптимальное количество обнаруженных целевых метаболитов составляет от 2,78 до 10 до 1,67 до 10 до шести клеток, в то время как 1 умножить на 10 на семь клеток дает меньшее количество обнаруженных метаболитов, что обусловлено эффектами подавления ионов. Этот результат указывает на то, что оптимальное количество клеток для извлечения для этого анализа примерно равно количеству клеток в шестилуночной пластине. Для анализа нецелевых метаболитов для фильтрации таблицы компонентов используется пороговое значение CV в 20% и среднее значение интенсивности от 10 до седьмого.

Пороговые значения CV могут быть увеличены, в то время как средние значения интенсивности должны быть уменьшены, чтобы включить больше пиков После ручной проверки пиков компоненты с хорошей формой выбираются и ищутся в базе данных метаболомов человека. Здесь перечислены результаты по данным, собранным в положительном режиме, а результаты по отрицательному режиму — здесь. Некоторые из идентифицированных здесь метаболитов перекрываются с метаболитами в целевом списке, такими как глутатион и пролин.

Также исследуются дополнительные метаболиты, отсутствующие в целевом списке, такие как метилглиоксаль, который может быть получен в результате гликолиза и одного pto, два глицерина ELE SN, три фосфохолина, который обнаруживается в положительном режиме с временем удержания 3,2 минуты. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как извлечь полиметаболиты из культивируемых SARS, а затем использовать RC QES для измерения относительных уровней метаболизма в различных образцах. Спасибо за просмотр.