Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

Общая цель данной процедуры заключается в измерении локализации gabaa-рецепторов на поверхности мембраны и их эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Это достигается путем первоначальной трансфекции нейронов гиппокампа субъединицей gabaa-рецептора с меткой и последующего культивирования нейронов в инкубаторе. Вторым этапом является маркировка поверхностных gabaa-рецепторов с помощью alpha-bungarotoxin, конъюгированного с флуоресцентным красителем Alexa.

Затем нейроны инкубируют в течение различных промежутков времени, чтобы обеспечить эндоцитоз меченых рецепторов. Заключительным этапом является фиксация образцов в соответствующие моменты времени и проведение иммуноокрашивания с использованием анти-GFP для визуализации общего пула меченых рецепторов. В конечном итоге используется конфокальная микроскопия для демонстрации изменений в поверхностной локализации и эндоцитозе меченых рецепторов gabaa с помощью методов визуализации фиксированных клеток или живых систем.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области траффика рецепторов, такие как влияние связывания лиганда на скорость эндоцитоза и встраивания рецепторов, а также воздействие различных лигандов и модуляторов на рециклинг и деградацию рецепторов. Хотя этот метод использовался для изучения связанных с лигандами ионных каналов и рецепторов, сопряженных с G-белком, преимущественно в контексте нервной системы, его можно применять и для изучения динамической локализации и траффика других мембранных белков в клеточных культурах и первичных клетках различных тканей. Как правило, специалисты, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями по двум причинам.

Во-первых, необходимо создать функциональные конструкции, а во-вторых, получить практический опыт и навыки, необходимые для одновременной обработки нескольких временных точек. Для начала подготовьте от четырех до пяти круглых стеклянных покровных стекол, покрытых поли-D-лизином, в каждой чашке для культивирования тканей диаметром 3,5 сантиметра, как описано в текстовом протоколе. Затем в день культивирования проведите трансфекцию свежедиссоциированных нейронов с использованием от одного до четырех микрограммов DNA-плазмиды конструкции, подготовленной методом maxi-prep.

Трансфецированные нейроны на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизином, при конечной плотности примерно 200 000 нейронов на чашку диаметром 3,5 сантиметра. Замените среду через 4–24 часа после подготовки нейронных культур. Затем оставьте нейроны развиваться в инкубаторе до 14–17 дней in vitro или до достижения стадии, необходимой для проведения анализа эндоцитоза.

Сначала установите на настольном охлаждающем и нагревающем устройстве температуру 16 °C. Охладите внеклеточный гепатобуферный физраствор (HBS) до 16 °C на водяной бане. Перенесите чашки с нейронами на алюминиевую пластину при температуре 16 °C и охлаждайте в течение пяти минут.

Удалите среду и замените ее одним миллилитром HBS при 16 °C с добавлением 150 µM двух-Bo Rine на две минуты. Затем удалите среду в маркированный контейнер для отходов и замените ее одним миллилитром HBS при 16 °C с добавлением двух bo kerine и alpha bungalow toxin Alexa 594, выдерживая при 16 °C в течение 15 минут.

После инкубации перенесите среду в промаркированный контейнер для отходов и трижды промойте планшеты двумя миллилитрами HBS при 16 °C для проведения экспериментов по прижизненной визуализации временных рядов после эндоцитоза рецепторов, используя культуральный планшет диаметром 3,5 см со стекнианным дном. Перенесите планшет на подогреваемую платформу микроскопа и начните визуализацию с помощью конфокального или TURF-микроскопа. Подготовьте оборудование для работы с фиксированными покровными стеклами.

Перенесите покровные стекла для временной точки T=0 в чашку с 4% параформальдегидом и 4% сахарозой комнатной температуры на 20 минут для остальных временных точек. Замените HBS на кондиционированную уравновешенную среду при 37 °C и верните в инкубатор для проведения эндоцитоза при 37 °C в необходимые временные точки. Извлеките чашки из инкубатора и быстро промойте дважды двумя миллилитрами фосфатно-солевого буферного раствора (DPBS) комнатной температуры.

Затем зафиксируйте образец в 4%paraform aldehyde и 4%sucrose в течение 20 минут. По истечении 20 минут фиксации слейте 4%paraform aldehyde и 4%sucrose в контейнер для отходов и дважды промойте планшеты двумя миллилитрами DPBS комнатной температуры. Затем инкубируйте покровные стекла при комнатной температуре в течение 10 минут.

Раствор для блокировки при иммунофлуоресцентном окрашивании, содержащий 0,2% Triton X 100, используется для пермеабилизации нейронов, что позволяет провести иммуноокрашивание внутриклеточного пула рецепторов антителами к GFP и/или маркировать другие интересующие белки. Затем раствор для пермеабилизации удаляют, и предметные стекла с покровными стеклами инкубируют в блокирующем растворе без Triton X 100 в течение 20–30 минут. Затем проводят инкубацию покровных стекол с первичными антителами в блокирующем растворе в течение нескольких часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.

Промойте покровные стекла, выдержав их в DPBS в течение пяти минут; повторите процедуру промывки всего три раза. Затем инкубируйте покровные стекла с вторичными антителами в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре. Снова промойте покровные стекла трижды с использованием DPBS, как было описано ранее.

Затем закрепите каждое покровное стекло, удалив излишки жидкости с его тыльной стороны лабораторной салфеткой, после чего переверните покровное стекло на стекло-предмет с нанесенными четырьмя микролитрами среды для заключения. Выполните сбор изображений с помощью конфокальной микроскопии в слепом режиме относительно экспериментальных условий, используя иммерсионный объектив с масляным погружением с увеличением 60 x и числовой апертурой 1,49.

Используя те же настройки сбора изображений, получите изображения отдельных Z-срезов, на которых в фокусе находятся тело нейрона и несколько дендритных отростков; количественно определите сигнал флуоресцентного красителя Alexa для альфа-бунгаротоксина и иммуноокрашивание GFP вдоль 20 мкм трех-четырех проксимальных дендритов одного нейрона, используя один и тот же порог для анализа всех данных по эндоцитозу. Проанализируйте данные от 10 до 12 нейронов для каждой временной точки. Повторите эксперимент с использованием нескольких независимых культур нейронов.

ГАМКергические аксоны образуют тормозные контакты с дендритами пирамидных нейронов. Пресинаптические тормозные терминали идентифицируются по везикулярному транспортеру тормозных аминокислот, который переносит ГАМК и глицин в синаптические везикулы. Рецепторы ГАМК-А расположены в непосредственной близости от мест высвобождения нейромедиатора, которые закреплены постсинаптическим тормозным скаффолд-белком геином. Здесь показаны экспрессирующие alpha two phg F-P-B-B-S нейроны с поверхностными рецепторами gabaa, меченными токсином bungalow Alexa 5 9 4, с последующим иммуноокрашиванием всей популяции рецепторов антителами к GFP (показаны зеленым цветом), а также либо постсинаптическим тормозным скаффолд-белком геином, либо везикулярным транспортером тормозных аминокислот.

Здесь показан эндоцитоз ГАМК-A рецептора, содержащего субъединицу альфа-2, в нейронах гиппокампа через 15 дней in vitro под воздействием альфа-бунгаротоксина. Измерения флуоресценции отдельных дендритных отростков, представленные на панелях, нормализованы по уровню экспрессии конструкта с помощью антител к GFP. Сравнение различных временных точек осуществляется путем нормализации относительно измерений при T = 0.

Количественная оценка интернализации рецепторов за 60-минутный период на основе изменения интенсивности флуоресцентного сигнала во времени была наилучшим образом описана с помощью одноэкспоненциальной зависимости. Альтернативным подходом является отслеживание эндоцитоза рецепторов в одном нейроне с помощью прижизненной интервальной конфокальной микроскопии. В начале эксперимента видна точечная и перекрывающаяся флуоресценция рецепторов GABA A, меченных P-H-G-F-P, и рецепторов, меченных поверхностным альфа-бунгаротоксином; в ходе эксперимента сигнал от рецепторов GABA A, меченных альфа-бунгаротоксином, снижается по мере их эндоцитоза.

В то время как сигнал P-H-G-F-P остается высоким за счет встраивания новых рецепторов, минимальное снижение сигнала P-H-G-F-P после данной процедуры обусловлено изменениями в распределении рецепторов на поверхности клеток и фотообесцвечиванием. Для ответа на дополнительные вопросы, например, о скорости встраивания рецепторов при различных режимах обработки, могут быть использованы другие методы, такие как анализы с введением бунгаротоксина. Данная методика позволяет оценить, как клеточная активность, специфические белковые домены, агонисты и другие модуляторы могут изменять оборот рецепторов в живых нейронах, других клетках и тканях.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как использовать токсин alpha bungalow, конъюгированный с красителями Alexa, в сочетании со стандартными методами иммунофлуоресценции для количественного определения локализации поверхностных рецепторов в нейронах гиппокампа.