Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения
January 2nd, 2014
Пристройка вирионов к поверхности является обязательным условием для одной вирионной визуализации с помощью флуоресцентной визуализации суперпозвания или атомной силовой микроскопии (AFM). Здесь мы демонстрируем метод подготовки образца для контролируемого прикрас виньонов к стеклянным поверхностям, пригодным для использования в AFM и флуоресценции супер-разрешения.
Эта процедура подготавливает стеклопакеты с вирусами для использования в атомно-силовой микроскопии и микроскопии сверхвысокого разрешения, такой как флуоресцентная фотоактивированная локализация. Сначала очистите стеклянную подложку, покройте стекло тонкой пленкой частично биотинилированного полиэтиленгликоля, привитого к поли-L лизину. Далее обработайте поверхность авадоном, чтобы увеличить сродство связывания биотинилированной пленки.
Теперь обработайте поверхность биотинилированными антителами, специфичными для интересующего вируса. Затем обработайте подготовленную антителом поверхность с интересующим вирусом. В отличие от центрифугового покрытия, этот метод имеет преимущество в том, что варианты равномерно распределяются по поверхности.
Для того чтобы оптимизировать микроскопию, поместите чехлы чехлов вертикально в тефлоновую стойку для слипов соответствующего размера и погрузите их в стакан, наполненный фильтрованным этиловым спиртом ультразвуком, на 30 минут. Затем тщательно промойте чехол ультрачистой водой. Далее поместите чехол в отдельную чистую тефлоновую решетку и стакан, наполненный одним моляром гидроксида натрия на 30 минут и тщательно промойте сверхчистой водой.
Теперь просушите промытые чехлы под струей азота и переложите их на чистую сухую тефлоновую решетку. Убедитесь, что каждое защитное стекло очищено от видимой пленки или частиц. Сразу после сушки в потоке азота в горизонтальном положении поместите одну крышку-вкладыш в стерильную чашку Петри, на центр покровной прокладки пипетки нанесите соответствующее количество биотинилированного полилизина привитого полиэтиленгликоля в ПБС.
Поместите еще одну чистую крышку поверх жидкости методом бутерброда. Убедитесь, что объем между активными гранями двух покровных стекла полностью заполнен жидкостью. Накройте чашку Петри крышкой и выдерживайте при комнатной температуре от 45 до 60 минут.
Далее возьмите бутерброд пинцетом, не выдавливая лишнюю жидкость. Теперь большим и указательным пальцами слегка зажмите бутерброд горизонтально. Сдвиньте крышки в противоположных направлениях и разделите их, не касаясь активных граней.
Промойте оба активных лица 25 миллилитрами ультрачистой воды. Теперь высушите покровные стекла струей азота и отметьте, какие покровные стекла активны в стерильную чашку Петри. Положите обработанную защитную крышку с активной лицевой стороной вверх пипетку и нанесите соответствующее количество размороженного раствора на активную поверхность.
Поместите еще одну крышку активной лицевой стороной вниз, чтобы жидкость слиплась, затем выдерживайте при комнатной температуре в течение 25-30 минут. Затем разделите две крышки, как показано ранее. Следя за тем, чтобы не задевать активные лица.
Теперь промойте обе активные поверхности 25 миллилитрами ультрачистой воды, а затем высушите покровные стекла струей азота. Важно помнить, какие покровные слип-поверхности являются активными. Для дальнейшего использования немедленно поместите активный покровный лист активной лицевой стороной вверх в стерильную чашку Петри, нанесите пипеткой соответствующее количество размороженного биотинилированного антитела на середину активного лица.
Поместите еще одну защитную крышку активной лицевой стороной вниз поверх жидкости методом бутерброда. Затем выдерживайте при комнатной температуре от 45 до 60 минут Разделив две покровные полоски, промойте обе активные поверхности 25 миллилитрами PBS. Затем поместите обработанный антителами покровный лист активной лицевой стороной вверх в стерильную чашку Петри и нанесите пипеткой соответствующее количество вируса на середину активного лица.
Теперь прослайте со второй активной крышкой, слипните, накройте и инкубируйте. Теперь разделите две крышки. Промойте обе активные поверхности 25 миллилитрами PBS и переложите их на тефлоновую решетку и стакан, наполненный PBS.
Сразу же используйте подготовленные образцы или храните при температуре четыре градуса Цельсия до трех дней. Здесь. Варианы вируса везикулярного стоматита дикого типа были закреплены на поверхности стекла и проанализированы с помощью атомно-силовой микроскопии. Ширина и длина вириона составляют 80 нанометров на 180 нанометров, что свидетельствует о минимальных искажениях по сравнению с первоначальным размером вириона.
В этом эксперименте одиночный вирион был визуализирован с помощью флуоресцентной фотоактивационной локализионной микроскопии. С помощью Alexis 6 47 меченых антител VSVG. Синяя изоповерхность демонстрирует восстановленную поверхность вириона с помощью микроскопии FOM.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить стеклопакеты с вирусами для использования в атомно-силовой микроскопии или микроскопии сверхвысокого разрешения. Важно всегда помнить, на какой лицевой стороне защитного стекла есть активная химия.
Обзор
В этой статье представлен метод приготовления стеклянных покровных стеклянок с вирусами для использования в атомно-силовой микроскопии (АСМ) и флуоресцентной микроскопии сверхвысоким разрешением. Эта методика обеспечивает контролируемое прилипание вирионов, что позволяет получать высококачественные изображения вирусных структур.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Методы микроскопии
Предыстория
- Прилипание вирионов необходимо для таких методов визуализации, как АСМ и микроскопия сверхвысоким разрешением.
- Контролируемое прилипание улучшает качество результатов визуализации.
- Предыдущие методы могли не обеспечивать равномерное распределение вирионов.
- В этом исследовании представлен новый метод приготовления образцов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод прилипания вирионов к стеклянным поверхностям.
- Улучшить качество визуализации в АСМ и микроскопии сверхвысоким разрешением.
- Продемонстрировать эффективность метода с использованием вируса везикулярного стоматита.
Используемые методы
- Очистка и покрытие стеклянных покровных стеклянок биотинизированным полиэтиленгликолем.
- Обработка поверхностей авинидином и биотинизированными антителами, специфичными к вирусу.
- Скрепление покровных стеклянок для обеспечения равномерного распределения жидкости.
- Использование ультразвуковой обработки и техник промывания для обеспечения чистоты.
Основные результаты
- Вирион были успешно закреплены на стеклянных поверхностях для визуализации.
- Отдельные вирионы были изображены с минимальной деформацией с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Метод продемонстрировал эффективное распределение вирионов по поверхности.
- Результаты подтвердили жизнеспособность метода приготовления для высококачественной визуализации.
Выводы
- Разработанный метод обеспечивает надежный подход к прилипанию вирионов.
- Эта техника повышает качество визуализации в приложениях микроскопии.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для различных вирусных визуализаций.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
