Методы содействия росту микроорганизмов в потоках отходов целлюлозного завода и характеристика потенциала биодеградации культивируемых микробов

Общая цель данного эксперимента заключается в определении способности микроорганизма или консорциума микроорганизмов утилизировать отходы производства целлюлозы Black Liquor for Growth, компоненты черного щелока, используемые для роста, и продукты, образующиеся в результате микробного метаболизма этих отходов целлюлозы. Это достигается путем сбора отходов варки черного щелока и подготовки его к использованию в качестве компонента питательной среды. На втором этапе экстрагируются компоненты лигноцеллюлозы, которые используются для определения потребностей микроорганизмов в источнике углерода.

Затем подготавливаются, инокулируются и анализируются на предмет роста микроорганизмов с целью определения способности микроорганизмов расти на черном щелоке и его компонентах. Результаты показывают использование черного щелока в качестве единственного источника углерода для роста и синтеза продуктов метаболизма микробным изолятом окружающей среды, основанным на его росте, визуализированном на агаровых пластинах с минимальной средой, и GCMS. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обсуждали возможность выращивания микробов на отходах целлюлозы и что мы могли бы изолировать эти микробы непосредственно на целлюлозном заводе.

Основным преимуществом метода экстракции цинальной целлозы по сравнению с существующим на сегодняшний день методом, таким как отбеливание гидроксидом натрия, является то, что отбеливание хлоридом натрия обеспечивает высокую и повышенную чистоту. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Как и в случае с целлюлозой Тео и GCMS, этапы подготовки образцов сложны для изучения, и это связано с количеством необходимых этапов и визуальным определением, необходимым для проверки завершения процесса.

Этот метод не только может дать представление о микробном разложении черного щелока, но и может быть применен к потокам промышленных отходов, содержащих целлюлозу Magno, таким как растительные остатки, лесные остатки и твердые бытовые отходы. Чтобы начать эту процедуру, соберите образец черного ликера из выпускного клапана, прикрепленного к варочному котлу и стерильной стеклянной бутылке, и дайте ему остыть до комнатной температуры, прежде чем переходить к следующему этапу. Затем добавьте 100 миллилитров образца черного настоя в 500-миллилитровый стакан, оснащенный мешалкой и перемешивайте образец на средней скорости.

Нейтрализуйте черный щелок, добавляя фосфорную кислоту по каплям, пока он не станет вязким. После этого аликвотируют весь раствор черного щелока в 50 миллилитровые конические пробирки и центрифугируют образцы при давлении 9 300 G в течение 30 минут. Чтобы отделить углеводы, поместите пять граммов молотого проса размером один миллиметр или меньше и брусок для размешивания в колбу объемом 500 миллилитров.

Затем добавьте 200 миллилитров дистиллированной воды, 7,5 грамм хлорита натрия и 2,5 миллилитра ледяной уксусной кислоты. Поместите колбу на масляную баню, поставленную поверх тарелки для перемешивания при температуре 80 градусов Цельсия, на один час. Затем добавьте в колбу дополнительно 7,5 грамм хлорида натрия и 2,5 миллилитра ледяной уксусной кислоты.

Продолжайте помешивать при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30 минут, повторив предыдущий шаг два раза. Дайте раствору остыть до комнатной температуры. Затем отфильтруйте его через воронку Бюхнера под вакуумом, чтобы изолировать твердый материал.

Твердый материал промыть три раза 100 миллилитрами дистиллированной воды. Затем соберите один грамм твердого материала и положите его на чистый лист фильтровальной бумаги. Поместите твердое вещество при температуре 50 градусов Цельсия для высыхания на ночь.

После извлечения образца из печи на следующий день переложите его в пробирку для хранения с маркировкой полых ячеек. Добавьте оставшийся твердый материал в колбу объемом 500 миллилитров, содержащую 250 миллилитров 10% гидроксида натрия, и закройте колбу пробкой. Поместите раствор в инкубатор при температуре 70 градусов Цельсия на один час с встряхиванием при 250 об/мин.

После этого дайте раствору остыть до комнатной температуры Через 30 минут изолируйте твердый материал с помощью вакуумной фильтрации с помощью воронки Бюхнера. После того, как твердый остаток высохнет в течение ночи в духовке при температуре 50 градусов Цельсия, поместите его в пробирку для хранения с маркировкой «целлюлоза». Переложите фильтрат в колбу объемом 500 миллилитров и добавьте 30 миллилитров уксусной кислоты и 250 миллилитров крышки изопропилового спирта и поместите полученный раствор на столешницу не менее чем на восемь часов при комнатной температуре.

Когда закончите, перелейте весь раствор в конические пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируйте образец при давлении 9 300 G в течение 30 минут. После центрифугирования осторожно пипеткой извлеките раствор из конических пробирок и выбросьте. Далее промойте гранулы 30 миллилитрами дистиллированной воды методом вортексинга и центрифугируйте при 9 300 G в течение 30 минут.

Повторите этот шаг 15 раз, чтобы тщательно вымыть гранулы. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, чтобы изолировать гранулы для сублимационной сушки. После того, как образец был лиофилизирован, поместите его во флакон с маркировкой «Полуцеллюлоза».

Для отделения лигнина добавьте пять граммов молотого проса размером один миллиметр или меньше в 500-миллилитровый раствор гидроксида молярного натрия точки 25 и 30% этанола. Поместите суспензию в инкубатор при температуре 75 градусов Цельсия с встряхиванием при 250 об/мин в течение двух часов. Процедив остывший раствор, добавьте в колбу мешалку и поместите ее поверх мешалки, отрегулированной на среднюю скорость.

Добавляйте концентрированную соляную кислоту по каплям в фильтрат до тех пор, пока не будет получен pH два. Оставьте раствор на ночь при комнатной температуре. После того, как раствор был перенесен в конические пробирки объемом 50 миллилитров, центрифугируйте образцы при давлении 9 300 GS в течение 30 минут.

Когда закончите, осторожно извлеките раствор из конической трубки и выбросьте. Промойте гранулу 30 миллилитрами дистиллированной воды методом вортексирования и центрифугируйте при температуре 9 300 G в течение 30 минут. Повторите этот шаг 15 раз, чтобы тщательно вымыть гранулы.

После центрифугирования удалите лежачий натант, чтобы изолировать гранулу для сублимационной сушки. После сублимационной сушки поместите образец во флакон с маркировкой лигнин. Добавьте 50 миллилитров стерильных М девяти минимальных сред в стерильную колбу объемом 125 миллилитров.

Затем добавьте в среду 10% по объему черного щелока. Для посева добавляют в смесь 0,1%-ный объем ночной бактериальной культуры, инкубируют культуры при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с встряхиванием при 200 об/мин. В середине логарифмической фазы перенесите бактерии в герметичный стерильный флакон с анаэробной сывороткой с помощью шприца после центрифугирования инокулированных и инокулированных бактериальных культур ООН.

После 450 часов роста добавьте по 10 миллилитров каждой надосадочной жидкости в отдельные стеклянные пробирки. Подкислите каждую надосадочную жидкость концентрированной соляной кислотой, добавленной по каплям до pH от одного до двух. Для каждого образца добавьте в наднатан по 30 миллилитров этилацетата.

Закупорив пробирку, перемешайте раствор, перевернув пробирку четыре-шесть раз. Затем поместите один-два грамма безводного сульфата натрия в чистую стеклянную пробирку. Аккуратно соберите верхний органический слой с помощью пипетирования с помощью одноразовой стеклянной пастбищной пипетки.

Поместите органический слой в пробирку, содержащую безводный сульфат натрия. Обезвоживайте органический слой над безводным сульфатом натрия, осторожно постукивая по пробирке, чтобы постепенно перемешать. Добавьте небольшое количество безводного сульфата натрия и перемешайте до тех пор, пока не исчезнут большие комки.

После этого отфильтруйте раствор через воронку Бюхнера под вакуумом, затем переложите раствор в испарительную колбу и испарите фильтрат с помощью ротационного испарителя. Когда закончите, поместите три миллиграмма остатков экстракции этилацетата в двухмиллилитровый флакон для янтарной хроматографии. Растворите остаток со 100 микролитрами одного четыре диоксана и 10 микролитрами пиридина.

Затем добавьте во флакон 50 микролитров раствора B-S-T-F-A с 1%-ным триметилхлором. Поместите раствор в инкубатор при температуре 60 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 15 минут. Проанализируйте образец с помощью GCMS.

Сбор и модификация черного щелока, образующегося в процессе крафтовой целлюлозы, позволит использовать эти отходы целлюлозы для определения способности к биоразложению одного бактериального изолята или смешанной культуры. Здесь показан аэробный рост, измеренный по оптической плотности штамма окружающей среды, культивируемого в средах LB и средах LB с добавлением 10% нейтрализованного черного щелока. Эти результаты свидетельствуют о том, что эта бактерия растет в присутствии черного щелока.

Рост изолята окружающей среды в средах LB происходит быстрее, чем при выращивании в присутствии черного щелока, но оптическая плотность начинает снижаться через 62 часа. В то время как рост микробного изолята окружающей среды в присутствии черного щелока продолжает увеличиваться в оптической плотности до 230 часов роста. Кривая роста микробного изолята окружающей среды в присутствии черного щелока также показывает двухфазный рост, что позволяет предположить, что черный щелок содержит более одного источника углерода, который может быть использован микробным изолятом окружающей среды, и что бактерия отдает предпочтение использованию питательных веществ.

Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы определить его способность использовать черный щелок для удовлетворения потребностей роста. Можно также определить рост бактерии на ненейтрализованном черном щелоке или определить влияние повышенных концентраций черного щелока на рост. После демонстрации роста на черном щелоке можно определить использование источника углерода с помощью экспериментов с минимальным ростом среды.

Коммерческие субстраты, входящие в состав лигноцеллюлозы, могут быть использованы в качестве источников углерода в минимальных средах. Представленный здесь протокол экстракции лигноцеллюлозы обеспечивает модель для определения потребностей в росте бактерии, изображенной на рисунке. Минимальная среда агара дополнена каждым компонентом экстракции лигноцеллюлозы.

Наличие колоний на агаровых пластинах с минимальной средой указывает на способность изолята окружающей среды разлагать голоцеллюлозу, целлюлозу, гемицеллюлозу и колонии лигнина, присутствующие на М-9. Минимальное количество сред может указывать на способность изолята окружающей среды разлагать агар, а не пластины. Минимальные кривые роста среды для жидких культур также могут быть использованы для определения специфической скорости роста каждой фракции лигноцеллюлозы, чтобы не нужно было добавлять агар, который может быть потенциальным источником углерода.

Анализ извлеченных и производных глаз, бактериальных культур с помощью GCMS позволяет выявить производимые продукты метаболизма. Здесь показан спектр производных ТМС GCMS, присутствующих в неинокулированном образце, спектр производных ТМС, полученных микробным изолятом окружающей среды при анаэробном выращивании, и M девять, минимальная среда с 10% ненейтрализованным черным щелоком. Сравнение двух спектров выявило различия в компонентах, присутствующих в средах, что свидетельствует о наличии продуктов брожения и деградации компонентов черного щелока.

У инокулированного образца наблюдался пик со временем удержания 39,34 минуты. Пик с временем удержания 21 целых 84 мин увеличивался в инокулированном образце. В инокулированном образце снизился пик со временем удержания 25,79.

Показанный здесь спектр соответствует спектру стандарта гуак, который был использован для определения пика с временем удержания 25,79 минут. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить, может ли микроорганизм или консорциум микроорганизмов разлагать черный ликер. Кроме того, следуя этому протоколу, вы можете использовать другие методы, такие как кривые роста, чтобы ответить на дополнительные вопросы о скорости роста микроорганизма или микроорганизмов при различных концентрациях компонентов экстракта черного щелока или лигона.