Изображений Очищенные нетронутыми биологических систем на клеточном уровне по 3DISCO

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить изображение флуоресцентно меченных интактных биологических образцов без гистологического среза. Это достигается путем последовательной инкубации неподвижных тканей в органических растворителях до достижения полной прозрачности. В качестве второго шага.

Прозрачные ткани визуализируются в 3D с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Затем анализируются результаты визуализации, и нейронные структуры в неразрезанных спинном и головном мозге могут быть реконструированы в 3D по собранным трем диско-изображениям. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии о том, как картировать нейронные и GAL-связи во всем головном и спинном мозге.

Применение этой техники распространяется и на терапию нейродегенерации, поскольку теперь мы можем визуализировать нейронную целостность во всей нервной системе. Хотя этот метод может дать представление об организации нервной системы, он также может быть применен к другим органам, таким как легкие или опухолевая ткань. После освоения этой техники требуется всего несколько часов для небольших органов, таких как спинной мозг или легкое, и около одного или двух дней для мозга. Начните процедуру с добавления двух-трех миллилитров свежеприготовленного 50% THF в один стеклянный флакон на собранную ткань.

Затем переложите неподвижные органы в раствор для очистки и надежно закройте флаконы. Поместите флаконы на вращатель и накройте их алюминиевой фольгой, помешивая образцы в течение соответствующего времени с постоянной скоростью 30 об/мин. Затем удалите очищающий раствор и с помощью нового полиэтилена или пипетки суспензируйте ткань в следующем растворе.

Как указано в таблице на заключительном этапе очистки, держите образцы в растворе до тех пор, пока они не станут полностью прозрачными для многофотонной или конфокальной микроскопии. Как только будет достигнута полная расчистка, установите образец на предметное стекло с этой целью. С помощью стоматологического цемента сделайте границу вокруг ткани.

Заполните бассейн окончательным раствором для очистки непосредственно перед тем, как стоматологический цемент станет полностью твердым, а затем немедленно поместите очищенный образец в центр бассейна и накройте его покровным стеклом. Нажмите на покровное стекло до тех пор, пока оно полностью не будет запечатано стоматологическим цементом и не коснется поверхности очищенного органа для световой листовой микроскопии, как только будет достигнуто полное очищение монтировки, а затем вручную поверните винт держателя образца для фиксации образца. Затем опустите образец в камеру визуализации светового листового микроскопа, заполненную окончательным очищающим раствором, подходящим для визуализируемой ткани.

Затем соберите Z-сканы, охватывающие все очищенные ткани, с наилучшим разрешением, которое может обеспечить микроскоп, увеличивая интересующие области для получения изображений с более высоким разрешением. После сбора изображений загрузите серию изображений в программное обеспечение Amira с помощью модуля resolve RT. Когда серия будет загружена, введите правильные размеры вокселей в окне параметров чтения изображения и нажмите OK.

Затем выберите подприложение мультипланарного вида. Затем с помощью ползунков «Первичная проекция» и «Толщина» выберите оптимальную толщину проекции и порог для значений серого. Наконец, используйте модуль обрезки углов для просмотра срезов в различных 3D-ориентациях.

Для визуализации образцов картирование структурной организации нейронов чрезвычайно важно для понимания того, как они функционируют в норме и при болезни. В то время как три дискотеки можно использовать на различных органах, они особенно полезны для отслеживания длинных нейронных связей в спинном и головном мозге. Например, с помощью ультрамикроскопического сканирования больших очищенных сегментов спинного мозга можно проследить аксональные связи на протяжении нескольких сантиметров в спинном мозге грызунов, как показано на этих изображениях.

Аналогичным образом, весь очищенный мозг мыши и гиппокамп могут быть визуализированы для отслеживания нейронных связей в мозге. При использовании конфокальной или многофотонной микроскопии разрешение изображения может быть значительно увеличено, особенно в измерении Z. Например, многофотонная визуализация очищенного спинного мозга у мышей линии GFPM позволяет получить бесшовное изображение на всей глубине спинного мозга от 1,5 до 2 миллиметров.

Конфокальная микроскопия очищенного спинного мозга обеспечивает улучшенное разрешение аналогичным образом. Мультифотонная микроскопическая визуализация очищенного мозга позволяет получать изображения с очень высоким разрешением для визуализации мельчайших деталей нейронных структур, включая дендритные шипы. Образцы для трех дискотек могут быть помечены различными способами.

Например, можно пометить всю сосудистую сеть головного и спинного мозга с помощью лектин-конъюгированных флуоресцентных индикаторов, которые можно использовать для изучения гематоэнцефалического барьера в норме и при заболеваниях. С помощью трех дискотек также можно визуализировать более мелкие клетки в больших тканях. Например, как микроглия, так и астроциты активно участвуют в патологии нейродегенерации, включая болезнь Альцгеймера и травматические повреждения.

С помощью трех дискотек можно изучить их плотность и распределение в спинном мозге. Также можно визуализировать ненейрональные ткани. Например, клетки Clara во всех легких грызунов могут быть иммунопомечены антителами и визуализированы без разделения на уровне отдельных клеток.

Точно так же можно очистить и визуализировать клетки в несанкционированной ткани поджелудочной железы. Например, флуоресцентно меченые альфа-клетки визуализируются после очищения на этих изображениях поджелудочной железы. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что, хотя этапы очистки и визуализации просты, анализ данных может быть сложным.

При применении этой процедуры важно визуализировать прозрачные ткани, как только будет достигнута полная прозрачность, потому что флуоресцентный сигнал со временем будет ухудшаться в очищающем растворе. Разработка этой техники проложила путь исследователям к изучению деталей и неповрежденных органов, таких как картирование нейронных сетей в мозге. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как очищать и визуализировать клеточные и субклеточные структуры в целых органах, а впоследствии визуализировать и анализировать их.