Био-слой интерферометрии для измерения кинетики белок-белковых взаимодействий и аллостерические лиганда Effects

Общей целью данного эксперимента является измерение кинетики белка, белковых взаимодействий и аллостерического влияния малых лигандов на эти взаимодействия с помощью биослойной интерферометрии, BLI. Это достигается путем приготовления одного из белков со специфическим биотином и иммобилизации его на поверхности стрептококка. Параллельно компания Aden покрывала биосенсоры.

На втором этапе сенсорный связанный белок подвергается воздействию буфера, содержащего его партнера по связыванию, и связывание измеряется в реальном времени по его влиянию на оптическую интерференцию на поверхности сенсора. Затем каждый сенсор переносится в буфер без связывающего партнера, чтобы измерить диссоциацию белка в режиме реального времени. Белковые комплексы.

Полученные результаты позволяют определить константы кинетической скорости связывания и диссоциации взаимодействующих белков и, следовательно, их аффинность связывания. Дальнейшие результаты показывают, что BLI может обнаруживать влияние малых лигандов на скорость диссоциации белкового белкового комплекса. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как поверхностный плазменный резонанс, заключается в том, что BLI не слишком чувствителен к изменениям показателя преломления.

Таким образом, этапы связывания и ассоциации могут включать изменения в малых лигандах, чтобы проверить их влияние на белок-белковые взаимодействия в режиме реального времени, хотя этот метод может дать представление о кинетике белок-белкового взаимодействия. Он также может применяться к различным комбинациям, таким как связывание белка с иммобилизованной ДНК или РНК или связывание липосомы с иммобилизованным белком. Начните этот эксперимент с настройки прибора BLI, как описано в текстовом протоколе.

Затем настройте дизайн эксперимента в программном обеспечении для сбора данных. Выберите новый эксперимент по кинетике на вкладке мастера экспериментов. Это представляет собой меню с вкладками со всеми шагами, которые должны быть определены на первой вкладке.

Определите столбцы, которые будут использоваться. На 96 лунке образцовая пластина. Назначьте столбцы для содержания буфера, белка, который необходимо обездвижить, или партнера по связыванию.

Для каждой ассоциации хорошо ввести концентрацию связывающего партнера, который будет использоваться. На второй вкладке определите все шаги, необходимые для проведения анализа. К ним относятся ассоциация базовой нагрузки и диссоциация связующего партнера.

Отдельные этапы анализа связываются с столбцами лунок на планшете для образца путем выбора этапа анализа и последующего двойного щелчка по соответствующему столбцу. Это программирует перемещение датчиков от одной колонны скважин к другой. Во время анализа начните с краткого базового этапа, связанного с первой колонной лунок с буфером для анализа, чтобы установить начальные сигналы BLI в 96-луночной пластине.

Затем свяжите этап загрузки с лунками, которые будут содержать биотинилированный белок. Используйте функцию порога для достижения заданного уровня привязки. Установите опцию порога, чтобы все датчики были перемещены в следующую колонну скважин.

Когда любой из сенсоров достигает порогового значения, включите еще один базовый этап в буфер для вымывания неиммобилизованных биотинилированных белков из сенсоров и установите новые стабильные базовые сигналы для основных анализов для определения глобальных констант скорости связывания и диссоциации. Далее свяжите ассоциацию. Подойдите к колонне лунок, которые содержат различные концентрации связующего партнера.

Отрегулируйте время шага таким образом, чтобы по крайней мере насыщающая концентрация связывающего партнера достигала равновесного сигнала связывания. Для этапа диссоциации назначьте датчики такими, чтобы они возвращались в четвертый столбец, в те же буферные лунки, которые использовались для дополнительной базовой линии перед ассоциацией. Время для этапов ассоциации и диссоциации может быть скорректировано в ходе эксперимента, если скорость медленнее или быстрее, чем ожидалось.

На третьей вкладке укажите места в лотке для датчиков, в которых будут находиться предварительно увлажненные датчики для анализа. Четвертая вкладка позволяет просматривать программу в графическом виде. На пятой вкладке введите необходимые данные, включая расположение файлов данных и желаемую температуру.

Для эксперимента. Предварительно намочите датчики со стрептавидиновым покрытием не менее 10 минут. Чтобы удалить защитное покрытие сахарозой, снимите штатив с датчиком из лотка для датчиков и вставьте пластину 96 лунки в дно лотка, вставив один угол пластины в ориентационную выемку на лотке.

Для колонки датчиков, которые будут использоваться, добавьте 200 микролитров буфера для анализа на лунку. В этой колонне 96-луночного планшета верните штатив с датчиками в лоток в правильной ориентации, как назначено Во время программирования заполните лунки планшета для образцов буфером для анализа или соответствующими разведениями белка. Избегайте образования пузырьков, так как они могут вызвать шум в оптическом сигнале.

Включите одну или несколько эталонных лунок, в которых отсутствует либо биотинилированный белок, либо связывающий партнер. Откройте дверцу прибора и обратите внимание на световой поток от плеча датчика. Вставьте лоток с датчиками в сцену так, чтобы язычки лотков были вставлены в слоты сцены.

Вставьте пластину с образцом в держатель пластины. Убедитесь, что пластина установлена ровно и в правильной ориентации, как указано на держателе пластины. Закройте дверцу и начните анализ из программы сбора данных.

Если датчики по-прежнему требуют предварительного смачивания, выберите вариант отсрочки начала эксперимента. Наконец, после того, как вся подготовка образцов завершена и планшет для образцов и лоток датчика загружены в прибор, нажмите кнопку «Перейти», чтобы запустить анализ. После запуска анализа откройте программное обеспечение для анализа данных и загрузите папку, содержащую данные.

Перейдите на вкладку «Обработка», чтобы увидеть меню пошаговой обработки и необработанные кинетические данные, которым каждому датчику присвоен свой цвет в разделе «Выбор данных». Нажмите кнопку выбора датчика на карте планшета для образца. В меню обработки укажите лунки для одного или двух датчиков управления в качестве опорных скважин.

Установите флажок вычитания и выберите опорные скважины, чтобы вычесть опорный сигнал из сигнала каждого другого датчика. Выровняйте все трассы так, чтобы Y был равен нулю, используя шаг выравнивания по оси Y. Затем выберите базовую линию в качестве шага выравнивания для временного диапазона.

Введите последние 10 секунд этого базового уровня. Щелчок на этом шаге базовой линии покажет выравнивание. Затем установите флажок «Межступенчатая коррекция», чтобы свести к минимуму сдвиги сигнала между этапами ассоциации и диссоциации.

Выберите линию к базовой линии или диссоциацию. В большинстве случаев выберите функцию фильтрации KY gole и нажмите на данные процесса, чтобы продолжить визуальный просмотр окончательных данных процесса на нижней правой панели. Чтобы проанализировать данные, перейдите на вкладку анализа в разделе Анализ данных для шага анализа, выберите ассоциацию и диссоциацию.

Для модели выберите один к одному, для подгонки выберите глобальный. Для группировки по выбранному цвету выберите r max unlinked by sensor, чтобы обеспечить независимую подгонку максимального сигнального отклика при насыщенном связывании партнера с иммобилизованным белком. Наконец, нажмите кнопку Fit Curves (Подогнать кривые), чтобы начать анализ нелинейной регрессии.

Изучите результаты аппроксимации, которые включают наложение регрессионных кривых на трассы данных датчиков, графики остатков аппроксимации, а также таблицу с определенными значениями параметров и статистикой. Здесь показана кинетика связывания и диссоциации BLI в реальном времени. Этот эксперимент был начат с 10-минутного базового шага, так как датчики были предварительно увлажнены, только на короткое время, затем биотинилированный эпсилон был загружен на датчики.

На всех остальных этапах не наблюдалось заметной диссоциации эпсилона, как видно из референсной кривой, к которой не был добавлен партнер по связыванию. Второй референсный сенсор был лишен мобилизованного белка и показал низкий уровень неспецифического связывания партнера по связыванию. Различные концентрации F1 минус эпсилон были использованы на этапе ассоциации для датчиков от A до F, чтобы глобально подогнать результаты и получить наилучшие значения для константы скорости ассоциации к константе скорости ассоциации, а также были обработаны результаты константы равновесной диссоциации KD, в результате чего были получены синие следы данных.

В этом случае эталонная трасса датчика была вычтена из трасс образца для коррекции неспецифического связывания партнера по связыванию и дрейфа сигнала системы. На этапе анализа данных все кривые были глобально подогнаны с помощью модели «один к одному», «один к одному». Глобальное соответствие предполагает полную диссоциацию связывающего партнера.

Здесь показан другой эксперимент, в котором фермент связывали с сенсорным иммобилизованным эпсилоном в присутствии одного миллимолара, A-T-P-A-D-T-A. Это предрасполагает большинство эпсилонных комплексов F1 к предположению о неингибирующем подтверждении, которое легко диссоциирует; затем датчики перемещают в диссоциационные лунки, содержащие пробирный буфер с различными лигандами. Это демонстрирует влияние различных лигандов на подтверждение эпсилона.

Например, воздействие магния А GP и фосфата резко замедлило чистую диссоциацию, что указывает на то, что эпсилон сдвигает подтверждение в плотно связанное ингибирующее состояние. При первой настройке анализов BLI важно включить контрольные группы для проверки неспецифического связывания белка с сенсорами и того, значительно ли неспецифическое связывание изменяется в зависимости от концентрации используемого белка. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как разрабатывать, программировать и анализировать анализы BLI для измерения кинетики белковых взаимодействий, и оценить это.

BLI позволяет напрямую проверить влияние малых лигандов на белковые взаимодействия.