Био-слой интерферометрии для измерения кинетики белок-белковых взаимодействий и аллостерические лиганда Effects

Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении кинетики белков, их взаимодействий и аллостерических эффектов малых лигандов на эти взаимодействия с использованием биослойной интерферометрии (BLI). Это достигается путем подготовки одного из белков со специфическим биотином и его параллельной иммобилизации на поверхности биосенсоров, покрытых стрептавидином.

На втором этапе белок, иммобилизованный на сенсоре, подвергается воздействию буфера, содержащего его партнера по связыванию; связывание измеряется в режиме реального времени по его влиянию на оптическую интерференцию на поверхности сенсора. Затем каждый сенсор переносят в буфер без партнера по связыванию для измерения диссоциации белка в режиме реального времени. Белковые комплексы.

Полученные результаты позволяют определить константы скорости кинетики связывания и диссоциации взаимодействующих белков и, следовательно, их аффинность. Дальнейшие результаты показывают, что метод BLI позволяет обнаруживать влияние малых лигандов на скорость диссоциации белок-белкового комплекса. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как поверхностный плазмонный резонанс, является то, что BLI не обладает избыточной чувствительностью к изменениям показателя преломления.

Таким образом, этапы связывания и ассоциации могут включать введение различных малых лигандов для проверки их влияния на белок-белковые взаимодействия в режиме реального времени. Хотя данный метод позволяет получить сведения о кинетике белок-белкового взаимодействия, он также может быть применен к другим комбинациям, таким как связывание белка с иммобилизованной ДНК или РНК или связывание липосом с иммобилизованным белком. Начните этот эксперимент с настройки прибора для BLI, как описано в текстовом протоколе.

Затем настройте план эксперимента в программном обеспечении для сбора данных. В окне мастера экспериментов выберите «новый кинетический эксперимент» (new kinetics experiment). Откроется меню с вкладками, в которых на первой вкладке необходимо определить все требуемые параметры.

Определите столбцы, которые будут использоваться. На планшете для образцов с 96 лунками назначьте столбцы для буфера, белка, который необходимо иммобилизовать, или связывающего партнера.

Для каждого взаимодействия введите концентрацию используемого партнера по связыванию. На второй вкладке определите все этапы, необходимые для проведения анализа. Они включают в себя установление базовой линии, загрузку, ассоциацию и диссоциацию партнера по связыванию.

Отдельные этапы анализа связываются с колонками лунок на планшете с образцами путем выбора этапа анализа и последующего двойного щелчка по соответствующей колонке. Это программирует перемещение сенсоров из одной колонки лунок в следующую. Во время проведения анализа начните с короткого этапа установления базовой линии, связанного с первой колонкой лунок с буфером для анализа, чтобы зафиксировать начальные сигналы BLI в 96-луночном планшете.

Затем свяжите этап загрузки с лунками, в которых будет находиться биотинилированный белок. Используйте функцию порога для достижения заданного уровня связывания. Настройте параметр порога так, чтобы все сенсоры переместились в следующий столбец лунок.

Когда любой из сенсоров достигает порогового значения, добавьте еще один этап установления базовой линии в буфере, чтобы отмыть неиммобилизованные биотинилированные белки с сенсоров и установить новые стабильные сигналы базовой линии. Для базовых анализов по определению глобальных констант скоростей связывания и диссоциации включите дополнительный этап базовой линии с сенсорами в новом столбце лунок с буфером перед этапом ассоциации. Затем свяжите этап ассоциации со столбцом лунок, содержащих различные концентрации партнера по связыванию.

Отрегулируйте время этапа таким образом, чтобы даже при насыщающей концентрации партнера по связыванию был достигнут равновесный сигнал связывания. Для этапа диссоциации укажите возврат сенсоров к четвертой колонке — тем же лункам с буфером, которые использовались для дополнительного установления базовой линии перед ассоциацией. Время этапов ассоциации и диссоциации можно скорректировать в ходе эксперимента, если скорость реакций окажется ниже или выше ожидаемой.

На третьей вкладке укажите позиции в лотке для сенсоров, в которых будут находиться предварительно увлажненные сенсоры для анализа. Четвертая вкладка позволяет выполнить графический просмотр программы. На пятой вкладке введите необходимые данные, включая путь к файлам данных и желаемую температуру.

Для проведения эксперимента предварительно увлажняйте сенсоры с покрытием из стрептавидина в течение не менее 10 минут. Чтобы удалить защитное сахарозное покрытие, извлеките кассету с сенсорами из лотка для сенсоров и поместите 96-луночный планшет в нижнюю часть лотка, совместив один угол планшета с ориентирующим пазом на лотке.

В колонку с датчиками, которые будут использоваться, добавьте по 200 µL рабочего буфера в каждую лунку. В этой колонке 96-луночного планшета установите кассету с датчиками в лоток в правильной ориентации, заданной при программировании; заполните лунки планшета с образцами рабочим буфером или соответствующими разведениями белка. Избегайте образования пузырьков, так как они могут вызвать шум в оптическом сигнале.

Добавьте одну или несколько контрольных лунок, в которых отсутствует либо биотинилированный белок, либо связывающий партнер. Откройте дверцу прибора и зафиксируйте световую отдачу от сенсорного рычага. Установите лоток с сенсорами на платформу, совместив выступы лотка с пазами платформы.

Установите планшет с образцами в держатель. Убедитесь, что планшет плотно прилегает к основанию и ориентирован правильно, согласно указаниям на держателе. Закройте дверцу и запустите анализ в программе сбора данных.

Если датчики все еще требуют предварительного увлажнения, выберите опцию задержки начала эксперимента. Наконец, когда вся подготовка образцов завершена, а планшет с образцами и лоток с датчиками установлены в прибор, нажмите кнопку «go» для запуска анализа. После завершения анализа откройте программное обеспечение для анализа данных и загрузите папку с данными.

Перейдите на вкладку обработки (processing), чтобы открыть пошаговое меню обработки и необработанные кинетические данные, где в разделе выбора данных (data selection) каждому сенсору присвоен свой цвет. Нажмите кнопку выбора сенсоров на карте планшета с образцами. В меню обработки назначьте лунки одного или двух контрольных сенсоров в качестве референсных лунок.

Отметьте флажком поле «Subtraction» (вычитание) и выберите контрольные лунки, чтобы вычесть референсный сигнал из сигналов всех остальных сенсоров. Выровняйте все кривые по оси Y относительно нуля, используя функцию «Align Y axis» (выравнивание оси Y). Затем в качестве этапа выравнивания для временного диапазона выберите «Baseline» (базовая линия).

Введите последние 10 секунд этого базового уровня. Нажатие на этот этап базового уровня отобразит выравнивание. Затем отметьте флажком поле «коррекция между этапами» (inter step correction), чтобы минимизировать сдвиги сигнала между этапами ассоциации и диссоциации.

Выберите линию для определения базовой линии или диссоциации. В большинстве случаев выбирайте функцию фильтрации KY gole и нажмите «process data», чтобы перейти к визуальному осмотру обработанных данных на панели в правом нижнем углу. Для анализа данных перейдите на вкладку «analysis» в разделе «data analysis», выберите шаг для анализа, а затем выберите «association» (ассоциация) и «dissociation» (диссоциация).

В поле «model» (модель) выберите «one to one for fitting» (один к одному для аппроксимации), затем выберите «global» (глобальный). В поле «group by» (группировать по) выберите «color» (цвет), а в поле «r max» выберите «unlinked by sensor» (несвязанный по сенсору), чтобы обеспечить независимую аппроксимацию максимального сигнала отклика при насыщающем связывании партнера с иммобилизованным белком. Наконец, нажмите «fit curves» (аппроксимировать кривые), чтобы начать нелинейный регрессионный анализ.

Изучите результаты аппроксимации, которые включают наложение регрессионных кривых на графики данных сенсора, графики остатков аппроксимации и таблицу с определенными значениями параметров и статистическими данными. Здесь представлены данные кинетики связывания и диссоциации BLI в реальном времени. Эксперимент начинался со стадии установления базовой линии в течение 10 минут, так как сенсоры были предварительно и лишь кратковременно увлажнены, после чего на сенсоры была нанесена биотинилированная epsilon.

На протяжении всех последующих этапов заметной диссоциации epsilon не наблюдалось, что подтверждается контрольной кривой, при записи которой партнер по связыванию не добавлялся. Второй контрольный сенсор не содержал мобилизованного белка и продемонстрировал низкий уровень неспецифического связывания партнера по связыванию. Для сенсоров A–F на этапе ассоциации использовались различные концентрации F1 минус epsilon с целью глобальной аппроксимации результатов и получения оптимальных значений константы скорости ассоциации и равновесной константы диссоциации KD; обработка полученных данных представлена синими кривыми.

В данном случае след эталонного сенсора был вычтен из следов образцов для коррекции неспецифического связывания партнера по связыванию и дрейфа сигнала системы. На этапе анализа данных все кривые были подвергнуты глобальной аппроксимации по модели один-к-одному. Глобальная аппроксимация предполагает полную диссоциацию партнера по связыванию.

Здесь представлен другой эксперимент, в котором фермент был связан с иммобилизованным на сенсоре epsilon в присутствии 1 mM ATP$\gamma$S. Это предрасполагает большинство комплексов F1 epsilon к принятию неингибирующей конформации, которая легко диссоциирует; затем сенсоры были перемещены в лунки для диссоциации, содержащие рабочий буфер с различными лигандами. Это демонстрирует влияние различных лигандов на конформацию epsilon.

Например, воздействие магния A GP и фосфата значительно замедлило чистую диссоциацию, что указывает на изменение конформации эпсилона в сторону тесно связанного ингибиторного состояния. При первоначальной постановке анализов BLI важно включить контрольные образцы для проверки неспецифического связывания белка с сенсорами, а также того, значительно ли меняется неспецифическое связывание в зависимости от используемых концентраций белка. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как планировать, программировать и анализировать тесты BLI для измерения кинетики белок-белковых взаимодействий, и осознать важность этого процесса.

Метод BLI позволяет напрямую проверить влияние малых лигандов на белок-белковые взаимодействия.