Нуклеозидтрифосфатов - от синтеза до биохимической характеризации

Общая цель данного видео – продемонстрировать процесс от синтеза модифицированных нуклеозидфосфатов до их полной биохимической характеристики. Это достигается путем предварительного преобразования надлежащим образом защищенного предшественника нуклеозидов в соответствующий трифосфат с применением четырехступенчатой процедуры «один горшок». Вторым этапом является очистка полученного трифосфата сначала с помощью осаждения, а затем с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой.

Далее, аналог трифосфата характеризуется ядерным магнитным резонансом и матричным лазером ДЕСОРБЦИЯ ионизации времени пролета или ЯМР и малофф для обеспечения высокой чистоты. Заключительным этапом являются реакции удлинения праймера и реакции полимеризации концевой дезоксинуклеотидтрансферазы или TDT. В конечном счете, продукты реакции и, следовательно, принятие трифосфата в субстрате анализируются с помощью гель-электрофореза.

Преимущество этого метода по сравнению с другими синтетическими стратегиями, такими как подход Борге, заключается в том, что образуется меньше побочных продуктов, и, таким образом, очистка проще. Как правило, новички в этой технике будут испытывать трудности, поскольку это довольно длительная и сложная процедура, требующая знаний в нескольких областях. Впервые у нас появилась идея снять этот метод, когда мы синтезировали модифицированные фосфаты, и нам было довольно сложно найти подробную процедуру.

Еще одно преимущество этого метода заключается в том, что он может быть использован для решения других вопросов в области модифицированных нуклеиновых кислот. Действительно, его можно использовать для отбора ферментов ДНК, которые катализируют широкий спектр реакций. Кроме того, этот метод может быть использован для функционального мечения нуклеиновых кислот.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы синтеза и очистки трудно изучить, поскольку трифосфаты являются полярными и активированными производными, с которыми необходимо обращаться осторожно. Для начала выпарите подходящий нуклеозид с тремя основными гидроксильными защитными свойствами дважды с двумя миллилитрами безводного пурина перед сушкой в вакууме в течение ночи. В то же время сухой пирофосфат аммония под вакуумом в течение ночи на следующий день растворял нуклеозид минимум в 200 микролитрах сухого пиридина.

Затем добавьте 400 микролитров сухого диоксана в качестве растворителя COS. Наконец, добавьте трехпроизводное циклического фосфора и дайте ему вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 45 минут. Далее приготовьте раствор сухого бутиламмонийпирофосфата в 170 микролитрах сухого диметилформамида и 58 микролитрах свежедистиллированного трибутиламина.

Добавьте полученный раствор в реакционную смесь и дайте ей вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 45 минут. Затем приготовьте раствор 160 микромолярного йода в 980 микролитрах пурина и 20 микролитрах воды. Добавьте раствор в реакционную смесь.

Для того, чтобы окислить альфа-фосфорный центр. Дайте полученному темному раствору размешаться при комнатной температуре в течение 30 минут. Используйте 10% водный раствор тиосульфата натрия для гашения избытка йода.

Удалите растворитель под вакуумом. Затем добавьте пять миллилитров воды и дайте смеси настояться при комнатной температуре в течение 30 минут для гидролиза циклического трифосфата моты. На этом этапе защитные группы обычно удаляются.

Следовательно, добавьте 30% гидроксид имодия в образец сырья. Перемешивайте в течение 1,5 часов при комнатной температуре, прежде чем удалить растворитель под вакуум. Далее добавьте два миллилитра воды и разделите смесь на трубочки-трубочки.

Добавьте 12 миллилитров 2%-ного раствора натрия на хлорат в ацетон и центрифугируйте в течение 30 минут перед повторением процедуры. Ещё один раз. Реагенты, используемые в синтезе из трифосфата, выпадают в осадок, образуя маслянистый остаток и обеспечивая отделение растворителей, что значительно упрощает последующую очистку ВЭЖХ в обратной фазе после сушки маслянистого остатка на воздухе.

Запишите спектр ЯМР P 31 образца сырой нефти в соответствии со стандартными процедурами. После ЯМР маслянистый остаток растворяют в четырех миллилитрах дистиллированной воды. Начните очистку ВЭЖХ с получения 50 миллимолярного бикарбоната триэтиламмония в ультрачистой воде в виде EENT A и в 50% ацетилнитриле в качестве EENT B, как подробно описано в текстовом протоколе, дегазируйте оба EENT под вакуумом и перемешивая в течение 20 минут.

Приготовьте аналитическую пробу, растворив 10 микролитров сырого трифосфата в 300 микролитрах дистиллированной воды. Затем с помощью градиента в диапазоне от 0% B до 100% B за 40 минут. Введите образец в систему ВЭЖХ, оснащенную полупрепаративной колонкой обратной фазы C 18.

Скорректируйте программу ВЭЖХ в соответствии со временем удержания трифосфата и дифосфата. Очистите сырую смесь, используя эти условия и, удалив ранние фракции, которые могут содержать некоторое количество дифосфата, соедините все фракции, содержащие продукт, и сублимизируйте. Затем совыпарить несколько раз сверхчистой водой.

Оценивайте чистоту трифосфата с помощью ЯМР и малоффа с применением стандартных протоколов. Типичные выходы, получаемые при применении данного протокола, лежат в диапазоне от 30 до 70% в зависимости от субстрата для пяти праймов и маркировки праймера. Смешайте праймер и реагенты, как указано в текстовом протоколе, и инкубируйте реакцию мечения при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Во время реакции мечения приготовьте колонку G 10 cidex, закупорив наконечник пипетки объемом один миллилитр силосированной стекловатой и заполнив наконечник раствором G 10. Убавьте обороты и промойте три раза 500 микролитрами воды двойной дистилляции и одну последнюю промывку 50 микролитрами воды двойной дистилляции. После инкубации реакции мечения при нагревании деактивируют киназу на 10 минут при температуре 70 градусов Цельсия.

Затем пропустите реакционную смесь через G 10. Чтобы удалить свободный гель с радиоактивной меткой, очистите радиомеченый праймер и восстановите с помощью метода измельчения и замачивания, осадите этанол и обессолите G 10 ускользающий олигонуклеотид. Для реакции удлинения праймера соедините один моль PICA радиоактивно меченного праймера, P один 10 молей PICA праймера, P один и 10 молей PICA матрицы, T один на 10 x реакционный буфер и встаньте на колени в горячей воде.

Затем постепенно остужайте до комнатной температуры в течение 45 минут. Положите пробирку на лед и добавьте нуклеозидфосфат или коктейль DNTP и одну единицу льда с ДНК-полимеразой. Завершите реакцию водой на общий объем 20 микролитров, инкубируйте при оптимальной рабочей температуре фермента.

Затем добавьте 20 микролитров стоп-раствора и нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Охладите, опустите образцы до нуля градусов по Цельсию. Перед рассасыванием методом денатурации полиакриламидным гелем электрофорезом.

Визуализируйте полосы с помощью фосфо-имиджера для полимеризации TDT, разбавляйте одноцепочечный немеченый праймер P two и радиомеченый праймер в одном микролитре TDT-буфера. Положите пробирку на лед и добавьте коктейль DNTP и полимеразу TDT, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. После инкубации добавьте 10 микролитров стоп-раствора перед нагреванием образцов при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите до нуля градусов Цельсия.

После разрешения образца методом денатурации электрофореза полиакриламидным гелем визуализируйте полосы с помощью фосфографического сканера. Здесь показан типичный спектр ЯМР P 31 модифицированного DNTP, в котором можно наблюдать характерные сигналы центров фосфора. Кроме того, сигналы исходят со стороны дифосфата и монофосфата.

На этом этапе всегда наблюдаются продукты с повышенным содержанием фосфатов. Здесь представлен анализ сырой смеси с использованием обратной фазы ВЭЖХ. Основной пик соответствует пяти основным фосфатам, в то время как основной побочный продукт, пять основных дифосфатов, демонстрирует несколько меньшее время удержания.

Наконец, после тщательной обратной фазы, очистки от ВЭЖХ, модифицированный DNTP характеризуется ЯМР и maldi. Здесь показан спектр maloff сульфаниламида и модифицированного аналога DUTP. Аддукт натрия можно увидеть при массовом перезаряде 712,54, и никаких следов дифосфата не присутствует. Как спектры ЯМР P 31, так и спектры протонного ЯМР имеют решающее значение для оценки чистоты модифицированного dps.

Поскольку присутствие нежелательного красителя и монофосфата дает характерные сигналы, проиллюстрированные ниже, ниже приведен результат первичных реакций удлинения с транспролином, модифицированным DUTP, модифицированным гистамином DATP и модифицированным валериановой кислотой DCTP, используемыми либо в качестве отдельных модификаций в виде комбинаций двух модифицированных DN dps, либо вместе, вместе с одним природным DGTP. Наконец, реакции полимеризации, опосредованные TDT с различными модифицированными аналогами DUTP, были проанализированы с помощью электрофореза с денатурирующим полиакриламидным гелем. В этом контексте цис-пролин модифицированный DUTP и пептидно-модифицированный DUTP являются лучшими субстратами для TDT.

Поскольку эффективность хвостообразования сопоставима или превышает эффективность природного DTTP, модифицированный мочевиной DUTP является довольно плохим субстратом в этом контексте. Поскольку олигонуклеотиды небольшого размера являются малодисперсными, можно наблюдать олигонуклеотиды более длинного размера После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за одну неделю, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что ядерные цитриковые фосфаты являются природными активированными строительными блоками, и поэтому следует соблюдать осторожность при обращении с ними после их создания.

Исследователи в области нуклеиновых кислот используют этот метод для изучения комбинаторных отборов для получения модифицированных аберов и каталитических нуклеиновых кислот. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как синтезировать и охарактеризовать модифицированные фосфаты с помощью четырехступенчатой процедуры one pop, за которой следует очистка ВЭЖХ в обратной фазе и реакции первичного удлинения. Некоторые экспериментальные детали, которые обычно не встречаются в экспериментальных разделах, станут очевидными.

Этот метод может быть использован в сочетании с другими методами, такими как ПЦР, для ответа на дополнительные вопросы. Действительно, он может быть использован для оценки совместимости модифицированных трифосфатов с методами селекции в VIO.