В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении белковых комплексов из живых эмбрионов дрозофилы с использованием метода кросс-линкинга in vivo. Для этого сначала тысячи мух помещают в популяционную клетку и собирают эмбрионы на ранних стадиях развития. Затем белки подвергают кросс-линкингу in vivo с помощью формальдегида, что стабилизирует их внутренние белковые комплексы.

Затем из эмбрионов с перекрестными сшивками готовят белковые экстракты для последующего иммунопреципитирования белковых комплексов. Результаты позволяют идентифицировать выделенные белковые комплексы с помощью вестерн-блот анализа. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как традиционное выделение белковых комплексов с использованием подходов in vitro, является то, что данный подход in vivo позволяет фиксировать транзиторные, но функционально значимые белок-белковые взаимодействия, которые могут не обнаруживаться традиционными методами in vitro.

Технику продемонстрирует доктор Min Gao, постдок из моей лаборатории. Сначала смешайте воду и агар-агар для мух с помощью перемешивающего элемента. Стерилизуйте эту смесь в автоклаве во время цикла автоклавирования.

Смешайте сахарозу с яблочным соком и нагрейте смесь на плитке до 70 °C. Затем объедините смеси и дайте им остыть в течение 15 минут до затвердевания агара. Приготовьте свежий раствор метил-4-гидроксибензоата в этаноле.

Это консервант. Добавьте его в затвердевающую смесь и перемешивайте в течение пяти минут. Затем разлейте смесь по пластиковым или пенопластовым планшетам площадью 300 квадратных сантиметров, избегая образования пузырьков.

Храните планшеты при температуре four degrees Celsius и используйте их в течение одной недели. Подготовьте популяционную клетку с 40 000–50 000 мух, из которой будут собираться эмбрионы. Поместите в популяционную клетку два свежих планшета с кукурузным сиропом и патокой, посыпав поверхность каждого примерно four grams пекарских дрожжей.

Оставьте мух на этих чашках на 48 часов при 25 °C. Спустя два дня рассыпьте около одного грамма дрожжей на две чашки с яблочно-соковым агаром и замените ими чашки в клетке с популяцией. Через час замените чашки в клетке еще двумя чашками того же типа.

Две планшетки для сбора, которые мухи использовали в течение одного часа, будут заполнены эмбрионами. Подвесьте планшетку с эмбрионами и водой и с помощью кисти помогите их извлечь. Затем процедите их через двухслойное сито.

Верхний слой представляет собой стальную сетку с размером ячеек 850 мкм, а нижний — стальную сетку с размером ячеек 75 мкм. Эмбрионы будут скапливаться на более мелкой сетке, откуда их следует отделить от крупного мусора с помощью кисти. Перенесите эмбрионы в корзинку из мелкой нейлоновой сетки, изготовленную из верхней части конической пробирки объемом 50 мл.

Промойте эмбрионы в воде и промокните их через сетку бумажным полотенцем. Затем погрузите эмбрионы в 50% раствор гипохлорита натрия на три минуты. Перемешайте их в растворе, после чего тщательно промойте водой и промокните досуха.

Затем эмбрионы погружают в изопропанол примерно на 15 секунд. При перемешивании это позволяет разрушить скопления эмбрионов; процедура не должна занимать более 30 секунд. Промокните эмбрионы насухо, после чего перенесите их в раствор гептана на пять минут.

Часто перемешивайте гептан над эмбрионами с помощью пипетки, чтобы предотвратить их слипание, затем промокните эмбрионы насухо и промойте их в PBST. После трехминутного промывания перенесите эмбрионы вместе с сеткой в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл PBST. Извлеките сетку, оставив эмбрионы в растворе, и отберите объем эмбрионов от 100 до 300 µL.

Дайте эмбрионам осесть на дно, аспирируйте PBST и немедленно приступите к сшивке эмбрионов. Сначала добавьте к эмбрионам 10 milliliters свежеприготовленного 0.2% формальдегида в PBST. Инкубируйте их при осторожном перемешивании при 25 degrees Celsius в течение 10 минут.

После 10 минут реакции дайте эмбрионам осесть и удалите раствор. Затем быстро замените раствор 10 миллилитрами 0,25 молярного глицина в PBST для гашения реакции. Поместите пробирку в шейкер еще на пять минут. После гашения удалите раствор и промойте эмбрионы трижды, используя по 10 миллилитров PBST для каждого промывания.

Удалите остатки PBST с помощью аспирации пипеткой и храните эмбрионы при температуре -80 °C до востребования. С помощью гомогенизатора и 2 мл лизисного буфера гомогенизируйте 500 µL сшитых эмбрионов. Это потребует примерно 15 движений плотно прилегающим пестиком.

Перенесите лизат в микроцентрифужную пробирку и поместите ее на шейкер для осторожного перемешивания в течение 15 минут. Затем центрифугируйте лизат при 16, 000 GS в течение пяти минут. Перенесите супернатант в пробирку объемом 15 миллилитров.

Осадок можно утилизировать. Теперь к супернатанту добавьте 40 µL суспензии анти-HA агрегированных бусин. Поместите образец на шейкер примерно на 2,5 часа до завершения конъюгации с бусинами.

Осадите гранулы центрифугированием при 2 500 G в течение пяти минут. Оставьте в пробирке около 250 µL супернатанта и ресуспендируйте в нем гранулы. Перенесите суспендированные гранулы на фильтр с порами 10 мкм в центрифужной колонке.

Удалите раствор, центрифугируя образец в течение десяти секунд при 12 000 Gs. Промойте микросферы в колонке 200 µL промывочного буфера с последующим центрифугированием. Повторите эту процедуру в общей сложности три раза. Затем добавьте к микросферам 40 µL элюирующего буфера и инкубируйте их при 37 °C в течение 15 минут.

В течение этого периода осторожно встряхивайте пробирку каждые пять минут для сбора осадка. Еще раз центрифугируйте колонку при 12 000 g в течение 10 секунд. Эффективность кросс-линкинга и очистки сшитых двухбелковых комплексов анализировали с помощью SDS-PAGE на градиентном геле 3–7% с последующим вестерн-блоттингом. Эмбрионы, экспрессирующие HA-тег и белок GFP, использовали для мониторинга степени кросс-линкинга и тестирования различных концентраций формальдегида для данного протокола.

Большая часть GFP в обработанных эмбрионах не подверглась кросс-линкингу, поэтому этого не происходит. Образец с произвольно сшитым комплексом из двух белков сравнивали с контролем без кросс-линкинга. Два белка, которые не подверглись сшивке, видны в виде полосы 285 kilodalton, которая мигрирует свободно.

Сшитый комплекс двух белков имеет большую массу и мигрирует медленнее в сыром лизате белков. Примерно половина из двух белков была сшита in vivo. При элюции взаимодействующих партнеров с помощью HA-пептида в элюированной фракции после промывки гранул присутствовали как комплекс, так и свободный белок.

После удаления SDS в растворе остаются преимущественно свободные белки с минимальным количеством трубчатых комплексов. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как масс-спектрометрия, для получения дополнительных ответов, например, для идентификации белковых компонентов в изолированных комплексах.