Стенограмма и метаболитов профилирования по оценке табака Дерево и тополя в качестве сырья для био-основанной промышленности

Общая цель этой процедуры заключается в сборе и оптимизации данных секвенирования метаболитов и РНК из материала листьев табачного дерева для оценок, ориентированных на системную биологию. Это достигается путем предварительного сбора биологического материала ряда листьев развития. Вторым этапом является проведение экстракции материала с использованием соответствующих растворителей в зависимости от последующего анализа.

Затем метаболиты и углеводороды измеряются с помощью газовой хроматографии, масс-спектрометрии или GCMS, а транскрипты анализируются с помощью сбора данных секвенирования РНК. В конечном счете, комбинация профилирования метаболитов и транскрипционного профилирования с помощью секвенирования РНК используется для того, чтобы показать, как листья табачного дерева развивают длинноцепочечные углеводороды и другие важные соединения. Этот метод может быть использован для идентификации и количественного определения важных полезных метаболитов, содержащихся в листьях табачного дерева.

Хотя этот метод может дать представление о метаболе табачного дерева. Его также можно использовать для других систем, таких как табак или родственные виды. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что из листьев табачного дерева трудно извлечь хорошую РНК.

В этом видео multi Bioo PRO вы увидите, как участники группы FERNA извлекают и профилируют метаболизм. Используя GCMS, вы также увидите, как член группы Fraser извлекает углеводороды, а также один член моей собственной группы, который будет извлекать РНК для секвенирования РНК. Начните с выращивания растений neko Oceana Glauca в горшках диаметром 30 сантиметров, содержащих M две профессиональные среды для выращивания, как подробно описано в текстовом протоколе для подготовки первичных метаболитов. Соберите листья и стебли растения и заморозьте материал, немедленно лиофилизируйте замороженное растительное сырье путем сублимационной сушки в течение трех дней, затем измельчите лиофилизированные образцы с помощью смесительной мельницы с металлическими шариками, измельчите полученные мелко измельченные сухие материалы в двухмиллилитровую центрифужную пробирку или стеклянный флакон. Далее аликвотируем 10 миллиграммов листьев или 20 миллиграммов стебля измельчаем сухой растительный материал в двухмиллилитровую винтовую крышку с круглым дном трубки.

Добавьте 1,4 миллилитра 100% метанола и вортекс на 10 секунд. Затем добавьте 60 микролитров реберного атола в качестве внутреннего количественного стандарта перед вортексом. В течение дополнительных 10 секунд добавьте один шарик из нержавеющей стали и гомогенизируйте материал с помощью смесительной мельницы в течение двух минут при частоте 25 Гц после центрифугирования в течение 10 минут.

При 11 000-кратном давлении перенесите надосадочную жидкость в стеклянный флакон. Добавьте 750 микролитров хлороформа и 1,5 миллилитра воды перед тем, как перемешать смесь в течение 10 секунд. Затем перелейте 150 микролитров из верхней фазы в свежую 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку.

Далее высушите образцы с помощью скоростного пылесоса. Крайне важно, чтобы образцы были сухими в течение от трех до 24 часов, пока не исчезнет остаточная жидкость. После высыхания добавьте 40 микролитров гидрохлорида метина.

Затем встряхните смесь в горизонтальном вибростенде в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте 70 микролитров смеси M-S-T-F-A перед тем, как снова встряхнуть в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Перед тем, как перелить жидкость в стеклянные флаконы, подходящие для анализа ГХ-МС, уменьшите капли на крышке путем короткого центрифугирования.

Вслед за GCMS анализирует данные путем настройки программного обеспечения для анализа данных масс-спектрометрии и выбора данных для обработки. Подготовьте таблицу обнаруженных пиков интереса в соответствии с составным классом. Идентификация пиков по коалиции стандартных соединений, последующее аннотирование обнаруженных пиков с помощью масс-спектрометрического анализа, алгоритмов структурной характеристики, обзора литературы и поиска в базе данных метаболитов для добычи углеводородов.

Погрузите примерно 200 миллиграммов свежесобранных листьев ncoa glauco на срок от двух до 20 минут, удалите листья и полностью высушите растворители путем ротационного испарения. Затем повторно суспендируйте образцы в одном миллилитре гексана ВЭЖХ. Перейдите к выполнению анализа образцов с помощью GCM с использованием параметров, подробно описанных в текстовом протоколе.

Первоначально обрабатывайте компоненты хроматограммы с помощью автоматизированной МС. Система деконволюции и идентификации и NIST 98 MS. Библиотека. Подтвердите идентификацию насыщенных длинноцепочечных углеводородов акана путем сравнения времени удержания и классических моделей фрагментации с известными достоверными стандартами. Затем определите углеводороды количественно путем сравнения интегрированных пиковых областей с кривыми реакции на дозу.

Построен на основе достоверных стандартов, расчет средних и стандартной погрешности средних с использованием программного обеспечения Excel. Этот протокол сочетает в себе экстракцию ТРИОЛ РНК с легким набором RN для получения высококачественной РНК: измельчение 100 миллиграммов замороженного растительного материала в двух миллилитровых центрифужных пробирках с металлическим шариком с помощью смесительной мельницы. После гомогенизации образца добавьте один миллилитр триола после центрифугирования материала в течение 10 минут при 12 000-кратном течении силы тяжести и четырех градусах Цельсия.

Перенесите надосадочную жидкость в новую реакционную пробирку. Добавьте 200 микролитров хлороформа и переверните трубку несколько раз перед инкубацией в течение трех минут при комнатной температуре. После центрифугирование смеси в течение 15 минут.

Как и раньше, перенесите верхнюю водную фазу в новую реакционную трубку. Добавьте примерно 2,5 объема этанола. Переверните трубку несколько раз и выдерживайте 30 минут при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Затем переместите образец, включая осадок, в спиновую колонну. Центрифугируйте колонку в течение 15 секунд при 8 000-кратном давлении и отбросьте поток. Добавьте 700 микролитров промывочного буфера RW, который предусмотрен в комплекте экстракции, в спиновую колонну и центрифугу.

Опять же, после отбрасывания проточной части, добавьте 500 микролитров второго промывочного буфера, также предусмотренного комплектом в отжимную колонку. Снова центрифугируйте колонку и отбросьте поток, прежде чем добавить больше буферного СИЗД и центрифугирование. Как и раньше, затем поместите спиновую колонку в новую реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 50 микролитров свободной воды РНК в центрифугу, колонку в течение одной минуты при 8 000-кратном давлении для элюирования РНК.

Удалите остаточную ДНК с помощью набора без ДНК в соответствии с инструкциями производителя. В качестве заключительного шага определите качество РНК. РНК должна иметь число целостности РНК выше восьми перед отправкой РНК для секвенирования следующего поколения.

Профиль ВЭЖХ показывает репрезентативный результат изопреноидного анализа экстрактов листьев ncoa glauca. Различные изопреноиды C 40 и выше были обнаружены с помощью детектора с помощью фотодиодной матрицы. Пики были аннотированы на основе кодовой хроматографии и спектрального сравнения между подлинными стандартами.

Две хроматограммы МС являются результатом первичного анализа метаболитов из ncoa, glauco листьев и стеблевого материала. Также приведен спектр МС пика, соответствующего серину, в качестве примера показан репрезентативный результат работы биоанализатора, используемого для определения качества РНК. Два основных пика на хроматограмме соответствуют рибосомам 18 с и 25 с, что указывает на интактную РНК в этом образце.

Дополнительные пики фрагментированной рибосомной РНК могут появиться в случае частичной или сильно деградированной РНК после освоения. Этот метод может быть выполнен быстро и совместим с анализом других метаболитов после этой процедуры. Другие методы, такие как ПЦР в реальном времени или другие способы анализа РНК, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как производство малых РНК или экспрессия определенных генов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее понимание того, как извлекать и оценивать данные метаболитов из табачного дерева.