Иммуногистохимические и кальция способы визуализации в Wholemount сетчатке крыс

Общая цель этой процедуры заключается в селективном мечении ганглиозных клеток сетчатки во всем препарате монтирования с помощью инъекции красителя индикатора кальция в культю зрительного нерва. Это достигается путем введения красителя с очень высоким сродством к показателю кальция, такого как Flow 4, в культю зрительного нерва. Затем сетчатка изолируется от наглазника и разделяется на квадранты для установки на предметное стекло В записывающей камере, настроенной таким образом, чтобы имитировать физиологические условия, вклад кальциевых каналов в кальциевый сигнал

В ганглиозных клетках сетчатки можно измерить в деполяризованных клетках с помощью блокаторов каналов. В конечном счете, полученные результаты могут обеспечить полуколичественные измерения вклада кальциевых каналов, образованных напряжением, в сигнал, такой как сигнал кальция с высоким содержанием калия. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как электропорация и объемная загрузка, является возможность селективного мечения ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов в целую монтировку препарата Store, рассеченных рад глаз и гибернации целевой средой или аналогичным раствором.

Теперь, если вы собираетесь проводить эксперименты с визуализацией кальция, заполните ганглиозные клетки сетчатки потоком четыре. Введите 0,5 микролитра 40 миллимолярного потока четырех пента-калийных солей, восстановленных в воде, в зрительный нерв, расположенный примерно на один миллиметр позади глазного яблока. Перенесите глазное яблоко на млекопитающих кольцевателей.

Пузырчатый с 95% кислорода, 5% углекислого газа или в течение часа при комнатной температуре. Храните заготовку в темноте. Препарируйте глаза под микроскопом с контролируемой интенсивностью света.

С помощью лезвия бритвы аккуратно сделайте небольшой разрез в передней части глазного яблока и удалите роговицу. Затем снимите хрусталик с внутренней поверхности сетчатки с помощью щипцов. Крепко держите склеру.

При удалении стекловидного тела с помощью других щипцов аккуратно отклеивайте основание стекловидного тела по направлению к центру сетчатки. Полученный препарат, называемый I-образной чашкой, может быть обработан для иммуногистохимического препарата целого монта, препарата кальциевой визуализации или подготовлен для поперечных срезов сетчатки для получения иммуногистохимического препарата для целого монтирования. Сначала сделайте четыре надреза на сетчатке, чтобы она лежала ровно.

Поместите сетчатку на предметное стекло на стеклянную крышку слоем ганглиозных клеток вниз. Во-вторых, добавьте каплю раствора в сетчатку глаза и при необходимости накройте ее целлюлозной фильтровальной бумагой, разровняйте сетчатку щеткой или щипцами. В-третьих, когда сетчатка станет полностью плоской и отсоединится от фильтровальной бумаги, поместите ее обратно в раствор.

Чтобы обработать препарат, сначала перенесите его в 4%-ный параформный альдегид на 10-15 минут. Затем трижды промойте сетчатку в 0,1 молярном фосфатном буфере при pH 7,4 в течение 30 минут за промывку в общей сложности 90 минут. Далее инкубируйте сетчатку в 500 микролитрах блокирующего раствора в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Этот раствор представляет собой 5% нормальную козью сыворотку или ослиную сыворотку в фосфатном буфере с 0,3% триттона и 0,1% азида натрия в течение следующих пяти-семи дней, инкубируют сетчатку в первичном растворе антитела при четырех градусах Цельсия. Состав этого решения должен быть получен эмпирическим путем. Смойте первичный раствор антитела так же, как был смыт фиксатор.

Затем инкубируйте сетчатку во вторичных антителах в концентрации от одного до 1000 в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Удалите вторичное антитело еще тремя промывками и фосфатным буфером. Затем установите сетчатку глаза для визуализации и заклейте ногтями лаком.

Эти предметные стекла необходимо хранить в темноте при температуре четыре градуса по Цельсию. Начните с подготовки к кальциевой визуализации всего монтирования из I чашки в звонарях. Во-первых, разрежьте ткань сетчатки на квадранты.

Поместите один квадрант на записывающую камеру так, чтобы слой ганглия был обращен вверх, а слой фоторецептора — вниз. Тщательно высушите окружающий участок салфеткой Ким и аккуратно положите смазанную маслом арфу на ткань. Теперь загрузите препарат сетчатки на буровую установку и завершите настройку восьмиканальной гравитационной системы суперфузии.

Если установленная сетчатка смещается после установки арфы, осторожно снимите и очистите арфу. Высушите область вокруг сетчатки и установите на место арфу. Соедините записывающую камеру с раствором млекопитающих и продолжайте непрерывно пузыриться с 95% кислорода, 5% углекислого газа.

Во-первых, в качестве контроля без лекарств, выполните два парных импульса с высоким содержанием калия от трех миллимоляров до 60 миллимоляров в течение 33 секунд. Деполяризуясь, РГК должен активировать напряжение зависимых кальциевых каналов, если препарат работает. Теперь приступайте к экспериментам.

Нифедипин и блокатор кальциевых каналов типа L обычно используются для оценки вклада кальциевых каналов типа L в вызванный кальциевым сигналом кобальта деполяризации. Неспецифический блокиратор кальциевых каналов может быть использован для селективной блокировки кальциевых каналов. Сканируйте препар каждые пять секунд, чтобы визуализировать и получить изображения флуоресцентного rgc.

Используйте как можно меньшую мощность лазера. Возбуждение должно быть установлено на 488 нанометров, а излучение должно собираться с помощью фильтра LP 505 нанометров. С использованием описанных протоколов проводили иммуномечение в отношении белка ганглиозных клеток R-B-P-M-S, который представляет собой РНК-связывающий белок с потоком многократного сплайсинга. Четыре.

Окрашивание действительно было ограничено ганглиозными клетками на основе спецификации антител. Затем был изучен вклад потенциально-зависимых кальциевых каналов в кальциевый сигнал в R-GC с использованием значений интенсивности флуоресценции, полученных от rgc. На исходных уровнях можно увидеть аксоны RGC и RGC, помеченные четвертым потоком.

Чтобы получить значения интенсивности флуоресценции, ROI помещали на ганглиозную клетку, соматы и/или аксоны. После нанесения высокого содержания калия на весь препарат монтировки флуоресцентный сигнал RG C'S увеличивался. За этим последовало последующее снижение значений интенсивности флуоресценции в присутствии кобальта во время второго импульса с высоким содержанием калия.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как избирательно нагружать ганглиозные клетки сетчатки синтетическим кальцием индикатора умирать в целом монтировании препарата.