Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Общая цель данного эксперимента заключается в скрининге интересующих соединений для определения их клеточной цитотоксичности и способности ингибировать дикий тип или лекарственно-устойчивый ВИЧ один в одном раунде инфекционного анализа. Это достигается путем предварительного воздействия на клетки соединений для поглощения, а затем инкубации обработанных клеток с люциферазой, экспрессирующей дикий тип или лекарственно-устойчивый ВИЧ. Затем можно измерить люциферазную активность вируса.

В конечном счете, сигнал считывания люциферазы может быть использован для количественной оценки ингибирования репликации вирусного вектора HIV V-one соединениями. Этот метод имеет терапевтическое значение, поскольку его можно использовать для скрининга новых соединений, которые демонстрируют лучшую эффективность против лекарственно-устойчивого ВИЧ. Такие соединения потенциально могут быть использованы в антиретровирусной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов с 1 93 клетками на 100 миллиметровых чашках с плотностью 1 500 000 клеток.

На следующий день трансфектируйте клетки 16 микрограммами ВИЧ дикого типа или мутантного ВИЧ и четырьмя микрограммами VSV с помощью приложения для метода фосфата кальция. Через шесть часов дважды промойте 2 93 клетки PBS, а затем инкубируйте их со свежей средой в течение 48 часов. Через два дня соберите вирус, содержащий S-надосадочную жидкость, из тарелок диаметром 100 мм и осветите надосадочную жидкость методом центрифугирования на низкой скорости в течение 10 минут при давлении 1620 G при комнатной температуре.

Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через шприцевой фильтр размером поры 45 микромоль и обработайте вирусные суспензии турбо-ДНК. Через 30 минут при комнатной температуре разведите вирус свежей средой и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы провести скрининг соединений в анализе на инфекционность за день до эксперимента, засейте 4000 представляющих интерес клеток в каждую лунку из 96.

Хорошо залейте 100 микролитров сред и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Через 24 часа последовательно разведите состав из стокового раствора в свежие среды. Окончательные выбранные концентрации будут зависеть от эмпирически определенного диапазона концентраций, как указано в таблице.

Далее добавляем серийное разведение соединений в лунки в трех экземплярах. При одной 10-й части объема конечной концентрации инкубируйте соответствующее разведение соединений с клетками в течение минимум трех часов. После инкубации с помощью многоканальной пипетки в каждую из лунок добавить по 100 микролитров разведенного вируса.

Примите отрицательные контрольные лунки. Затем инкубируйте пластины еще 48 часов. После инкубации используйте стеклянную пипетку, оснащенную наконечником для пипетки объемом 200 микролитров, чтобы отсасывать среду из лунок, начиная с верхней части среды и медленно двигаясь вниз к нижнему углу лунки.

Немедленно добавьте в каждую лунку 100 микролитров PBS с добавлением 0,5 миллимоляра хлорида магния, затем для измерения активности люциферазы добавьте 10 микролитров субстратного буфера из анализа репортерного гена люминесценции в каждый флакон поставляемого лиофилизированного реагента. Затем добавьте по 100 микролитров восстановленного реагента в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы дать возможность развиться сигналу. Наконец, считайте показания 96-луночной пластины с помощью микропланшетного люминометра.

Значения люциферазы, полученные при успешной процедуре скрининга соединений, представлены в таблице. Следует отметить, что потенциально мощные соединения проявляют повышенную активность люциферазы, причем контрольная группа демонстрирует самый высокий сигнал в этом репрезентативном трансплантате Калейдо. Концентрация соединения в зависимости от процента ингибирования активности Люцифера была построена на графике, чтобы определить, эффективно ли соединение в подавлении репликации дикого типа или лекарственно-устойчивого ВИЧ.

При попытке выполнить эту процедуру важно точно распределить равномерное количество клеток и вируса во всех лунках планшетов и убедиться, что в каждую лунку помещена правильная концентрация соединений.