Тонкослойная Хроматографическое (ТСХ) Разделение и Биоанализы растительных экстрактов для идентификации антимикробные соединения

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации растительных метаболитов, обладающих антимикробной активностью в отношении анаэробных бактерий. Это достигается путем первоначального разделения растительного экстракта методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Затем хроматограмма разрезается на зоны, содержащие одно или несколько соединений.

Затем зоны помещают на агар, инокулированный анаэробными бактериями, и инкубируют. После инкубации зоны удаляют, а планшеты окрашивают для выявления соединений, ингибирующих рост бактерий. Полученные данные позволяют определить наличие или отсутствие антимикробных растительных метаболитов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области питания жвачных животных, например, о влиянии вторичных метаболитов растений на использование питательных веществ конкретными микроорганизмами. Хотя данный метод выявляет растительные соединения, которые ингибируют бактерии рубца, он также может быть применен для поиска соединений, подавляющих рост других бактерий или грибков.

В данном протоколе фенольные соединения красного клевера будут использованы для демонстрации идентификации антимикробных соединений методом контактной биографии. Начните с очистки пластин для тонкослойной хроматографии (ТСХ), работая в вытяжном шкафу. Подготовьте достаточное количество очищающего растворителя, чтобы покрыть дно камеры для развития ТСХ, а также нижний край пластины ТСХ.

Подготовьте смесь этилацетата и метанола в соотношении два к одному, поместив ее в камеру. Далее, используя перчатки и работая в вытяжном шкафу, с помощью ножниц обрежьте гибкие силикагелевые пластины с алюминиевой или пластиковой подложкой так, чтобы они подходили по размеру к камере проявления.

Поместите пластинки в камеру так, чтобы их верхние края опирались на стенки камеры. Пластинки не должны касаться друг друга. Закройте камеру и дождитесь, пока растворитель поднимется по пластинкам за счет капиллярного эффекта.

Когда растворитель достигнет верхнего края пластин, извлеките их из камеры и установите вертикально в вытяжном шкафу до полного испарения растворителя. После высыхания пластин проверьте, не переместились ли примеси к верхней части пластин ТСХ. Они будут видны в виде желтой полосы при обычном свете или в виде флуоресцирующей полосы под ультрафиолетовым излучением.

Если большая часть пластинки все еще имеет желтоватый оттенок, повторите процесс очистки в той же камере для ТСХ, используя тот же растворитель. После извлечения пластинок из камеры удалите растворитель. Дайте остаткам растворителя полностью испариться, прежде чем использовать камеру для следующего этапа протокола.

Затем, чтобы удалить остаточную влагу, которая может повлиять на миграцию соединений на силикагеле, установите пластины вертикально в сушильный шкаф при 100 °C на 10–15 минут для пластин размером 20 × 20 см и на 5 минут для пластин размером 7 × 10 см. После высыхания дайте пластинам остыть до комнатной температуры перед нанесением экстрактов. Чтобы подготовить камеры для разделения экстрактов, с помощью ножниц вырежьте из фильтровальной бумаги полоску, высота которой будет чуть меньше высоты камеры, а ширина составит примерно половину периметра камеры.

Эта бумага будет служить фитилем для подъема растворителя по стенке камеры и насыщения пространства камеры парами растворителя, что повысит воспроизводимость разделения. Смешайте растворители в вытяжном шкафу. Используемые растворители — этилацетат и метанол в соотношении 4:1 по объему. Налейте смесь растворителей в камеру и закройте её крышкой.

С помощью карандаша слегка отметьте линию старта в точке на пластине для ТСХ, которая будет находиться выше уровня поверхности элюирующего растворителя в камере. Если адсорбент пластинки ТСХ мягкий и легко повреждается, нанесите метки по краям, как показано здесь. Затем растворите экстракты в достаточном количестве органического растворителя, чтобы получить концентрированный раствор вместо мутной суспензии.

В данном случае в качестве растворителя используется метанол. При использовании капиллярных микропипеток или микролитрового шприца стандарты и образцы наносятся в виде узких полос с сохранением односантиметрового отступа по краям пластинки; чтобы полосы высохли быстрее, можно обмахивать пластинку или поместить ее в вытяжной шкаф. После высыхания полос повторно нанесите образцы в те же места или методом наслоения.

Если на пластине требуется более высокая концентрация образца, при необходимости повторите процедуру в камере для ТСХ. Убедитесь, что весь фильтровальный жгут полностью пропитан растворителем. Затем с помощью пинцета или щипцов поместите пластины внутрь камеры для ТСХ.

Плитки не должны касаться фильтровальной бумаги. Закройте камеру и дождитесь завершения разделения веществ до того, как фронт растворителя достигнет верхней части плитки. Извлеките плитки из камеры для ТСХ и отметьте высоту фронта растворителя карандашом.

Дайте пластине высохнуть. В вытяжном шкафу проявите оставшиеся пластины ТСХ в той же камере для ТСХ, которая обычно пригодна для использования в течение всего дня при условии, что она остается закрытой. Если количество растворителя в камере заметно уменьшилось, приготовьте новую смесь растворителей после того, как пластины высохнут.

Визуализируйте полосы при видимом или УФ-излучении. Удобно использовать камеру для просмотра с портативной УФ-лампой, особенно если лампа позволяет обнаруживать соединения как при коротковолновом УФ-излучении 254 nanometer, так и при длинноволновом УФ-излучении 365 nanometer. Обведите полосы карандашом, а затем с помощью системы документирования гелей, оснащенной верхним, УФ- и/или видимым освещением, получите изображения пластин.

Наконец, для облегчения характеристики полос рассчитайте значения коэффициента удерживания или Rf: сначала измерьте расстояние, пройденное соединением, затем измерьте расстояние, пройденное растворителем, и разделите первое на второе. После того как положения полос будут отмечены, пластинки можно сохранить для последующего использования в биоанализе.

Оберните планшеты пленкой и накройте их фольгой. Храните планшеты при температуре -20 °C. Максимальный срок хранения зависит от стабильности соединения, так как силика не является нейтральным.

Некоторые соединения могут разлагаться непосредственно на пластине для ТСХ. В рамках подготовки к анализу контактной биографии приготовьте и инокулируйте среду для бактерий с высокой активностью аммиачного синтеза (HAB) в анаэробных условиях. В данном случае используется культура Clostridium stickland eye штамм sr.

Культивируйте микроорганизмы до экспоненциальной или стационарной фазы роста при 39 °C. При работе с анаэробными микроорганизмами используйте стерильные анаэробные методы. Приготовьте 0,75% (масса/объем).

Агар в той же среде, которая использовалась для выращивания бактерий, после охлаждения агара до температуры ниже 60 °C. Инокулируйте расплавленный агар культурой в объеме 1% об. чего к объему, осторожно перемешайте, немедленно поместите в анаэробную камеру и разлейте по пластиковым чашкам Петри размером 15 × 100 мм. С помощью ножниц вырежьте из пластины ТСХ зоны, содержащие интересующую полосу или полосы.

С помощью маркера пометьте обратную сторону планшетов. В качестве контроля поместите на агаровую пластину неиспользованную полоску ТСХ. Затем расположите полоски пятнами вниз на агаровые пластины.

Инкубируйте чашки с перевернутой стороной агара в инкубаторе анаэробной камеры в течение 24 часов при 39 °C. С помощью пинцета извлеките полоски ТСХ из чашек с агаром, находясь в анаэробной камере.

Покапельно нанесите тетраолеум красный на поверхность чашек с агаром. Оставьте для развития окраски минимум на 20 минут. Когда контрольная чашка станет полностью красной, извлеките чашки из анаэробной камеры.

Clostridium stick Landi представляет собой анаэробную бактерию, поэтому она начнет терять жизнеспособность сразу после извлечения из анаэробной камеры, однако окраска остается стабильной более 24 часов. Используя цифровую камеру, сфотографируйте планшеты при видимом свете на фоне, обеспечивающем достаточный контраст. При окрашивании живых клеток будет наблюдаться ярко-красный цвет.

Мертвые клетки не окрашиваются. Здесь представлены репрезентативные результаты разделения экстрактов красного клевера, содержащих фенольные соединения, методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле. Разделение в системе этилацетат-гексан (9:1) на расстоянии 8,5 см привело к образованию пяти зон, одна из которых была полностью отделена от старта.

В качестве стандартов были использованы Formin Bio Canon A и Genine. Четыре полосы с этой пластины наносили на культуры Clostridium stick Landi, руминальной бактерии с гиперпродукцией аммиака, на 24 часа, после чего окрашивали тетраолеум красным, как показано здесь. Инкубация с первой полосой Bio Canon A и частью второй полосы four Monon nein на посеянном бактериями агаре привела к образованию четко выраженной зоны ингибирования.

Однако инкубация оставшейся части полосы два вместе с полосами три и четыре не подавляла рост бактерий. Эти результаты продемонстрировали, что bio Canon A подавлял рост see stickland eye, но form aone Nein — нет. При выполнении данной процедуры важно помнить, что этот метод является гибким.

Можно использовать и другие тест-микроорганизмы при условии выбора соответствующих сред и включения контролей для подтверждения совместимости химии разделения и метода детекции с данной процедурой. Для характеристики антимикробных соединений, выявленных в ходе биоанализа, могут быть применены другие методы, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия.