Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Общая цель данной процедуры заключается в флуоресцентном мечении и количественном определении объема синтезируемой nascent RNA в условиях воздействия с использованием количественного анализа изображений. Культивируемые клетки, высеянные на покровные стекла, обрабатывают модифицированным алкиновым основанием 5-этинил-уридином (далее именуемым 5EU) с последующей инкубацией в условиях гипоксии.

Во время инкубации в процессе синтеза РНК включается 5-EU, что не нарушает работу клеточного аппарата транскрипции. Затем включенный 5-EU флуоресцентно маркируется с помощью реакции клика — медь-катализируемого азид-алкинового циклоприсоединения. После этого нативная РНК с флуоресцентной меткой визуализируется методом флуоресцентной микроскопии, а полученные изображения анализируются для сравнения количества РНК, синтезированной в условиях эксперимента и контроля.

Статистический анализ полученных данных демонстрирует изменения в генерации нативной РНК в ответ на гипоксию путем количественного определения включения пяти EU и детектирования с помощью флуоресцентной микроскопии. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как количественная ОТ-ПЦР, является возможность прямой визуализации продукции РНК в клетках на уровне единичных клеток. Хотя в данной работе мы используем этот метод для изучения клеточного ответа на низкое содержание кислорода, он также может быть применен для изучения ответов на воздействие химиотерапевтических препаратов.

Процедуру проведения дополнительных стресс-реакций продемонстрируют Джон Лестон, аспирант моей лаборатории, при помощи Иша Ковы, также аспиранта, и Хуманы Друкер, postdoctoral fellow. В завершение Гас Фергюсон продемонстрирует использование программного обеспечения для визуализации изображений. Начните эксперимент с погружения нескольких покровных стекол в 70% ethanol для их стерилизации.

Поместите покровные стекла на край планшета в боксе для работы с культурами тканей и дайте им высохнуть на воздухе под ламинарным потоком. После высыхания покровных стекол поместите по одному стеклу в каждую из шести чашек диаметром 3,5 сантиметра. Добавьте по 2 мл теплой полноценной среды DMEM в каждую чашку.

Надавите пинцетом, чтобы убедиться, что каждое покровное стекло плотно прилегает к дну лунки. Затем для отделения клеток U2 OS от чашки для культивирования тканей промойте их один раз тремя миллилитрами PBS. После этого добавьте четыре миллилитра подогретого 0.05%трипсина, 1%EDTA и инкубируйте при 37 °C в течение семи минут.

По истечении семи минут ресуспендируйте клетки в 6 мл теплой полной среды DMEM для инактивации трипсина-ЭДТА. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и перенесите по 2 × 10⁵ клеток в каждую чашку диаметром 3,5 см, содержащую покровные стекла. Осторожно покачайте чашку, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, 21% кислорода и 5% углекислого газа для адгезии клеток.

На следующий день извлеките пять чашек из инкубатора. Оставьте одну оставшуюся чашку нетронутой; она будет служить положительным контролем при нормоксии.

Поместите четыре чашки в гипоксическую станцию. Подвергните клетки воздействию гипоксических условий в течение 75 минут, 90 минут, двух часов и 24 часов. В другую чашку.

Добавьте актиномицин D в среду до конечной концентрации 10 µg/mL и верните ее в инкубатор при 37 °C в условиях нормального содержания кислорода на четыре часа. Эта чашка служит негативным контролем при нормоксии. Пока клетки инкубируются, подготовьте и соберите следующие реагенты для проведения анализа click-it.

Набор для анализа Click-it: PBS с pH от 7,2 до 7,6, 3,7% параформальдегид в PBS, 1% Triton X 100 в PBS, деионизированная вода, диметилсульфоксид, 10 M гидроксид натрия, 37% соляная кислота и индикаторные полоски pH. Необходимо подготовиться к началу проведения анализа с меткой в условиях соответствующего воздействия. За один час до завершения воздействия гипоксии подготовьте 2x рабочий раствор EU из 100 mM стокового раствора в предварительно нагретой полной среде для маркировки клеток.

Затем добавьте в среду в чашке с клетками, обработанными актиномицином D, равный объем 2X EU, чтобы развести EU до рабочей концентрации. Затем в гипоксической камере добавьте стоковый раствор EU к клеткам, подвергнутым гипоксии. Инкубируйте в течение одного часа в условиях культивирования клеток после обработки гипоксией или в течение четырех часов для контрольных групп.

Промойте каждую лунку один раз раствором PBS и добавьте один миллилитр 3.7% стокового раствора параформальдегида в условиях обработки, инкубируйте в течение 15 минут в условиях обработки. После фиксации извлеките клетки из гипоксической камеры и поместите их в вытяжной шкаф. Слейте фиксатор, соблюдая правила ответственной утилизации отходов параформальдегида.

Затем однократно промойте клетки с помощью PBS. Последующие этапы выполняйте при комнатной температуре, храня все растворы на льду при температуре от 2 до 6 °C. Далее, для пермеабилизации клеток, удалите промывочный раствор и добавьте в каждую лунку 1 мл 1% Triton X 100 в PBS; инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Удалите буфер для пермеабилизации и один раз промойте каждую лунку PBS. Удалите промывочный раствор из лунок с клетками и добавьте в каждый образец 500 µL свежеприготовленного реакционного коктейля из набора для визуализации РНК. Защитите клетки от света и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.

После инкубации удалите реакционную смесь, коктейль и промывочный раствор из набора для визуализации РНК. Промойте образцы 1 mL буфера из набора для визуализации РНК; если требуется дополнительное мечение антителами, его следует провести на данном этапе. Для окрашивания ДНК промойте образцы PBS, затем разведите herst 3, 3, 3, 4, 2 в пропорции 1:1000.

В PBS добавьте по одному миллилитру разбавленного раствора HERC в каждую лунку. Тщательно защитите от света и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации удалите раствор HERC и дважды промойте клетки с помощью PBS перед установкой покровных стекол.

Нанесите 10 µL среды для заключения в центр стандартного предметного стекла. Накройте каплю среды покровным стеклом, прижимая его стороной с ячейкой вниз. Избегайте образования пузырьков воздуха, так как они будут препятствовать последующему получению изображений.

Нанесите бесцветный лак для ногтей по периметру покровного стекла, чтобы зафиксировать его на предметном стекле. Дайте лаку высохнуть в течение пяти минут при комнатной температуре. Образцы, защищенные от света, можно хранить при температуре -20 °C.

После фиксации образца на предметном стекле получите изображения с помощью широкопольного микроскопа с возможностью флуоресцентной детекции. Проведите съемку, используя масляный иммерсионный объектив 40X с числовой апертурой NA 1.30, и зафиксируйте изображения с помощью камеры с охлаждаемой ПЗС-матрицей. После получения снимков проанализируйте не менее 30 клеток.

Используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы выполнить деконволюцию снимков. Это позволит исправить оптические искажения путем применения программного математического алгоритма к полученным изображениям. В результате получится более четкое изображение, что гарантирует ограничение последующего анализа только визуализированными клетками.

Затем импортируйте изображения в клиент Omer O. Рядом будут отображены эскизы всех полученных изображений для нормализации настроек визуализации для всех снимков в рамках одного эксперимента. Примените настройки визуализации контрольных клеток в условиях нормоксии ко всем остальным условиям, используя инструмент выделения области интереса ROI в программном обеспечении для анализа.

Выберите ядра на каждом изображении в программном обеспечении. Выберите опцию анализа интенсивности и определите среднюю интенсивность для каждого ROI для 30–50 клеток. Сохраните данные, затем рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение для каждого условия.

Наконец, с помощью программного обеспечения для построения графиков постройте диаграммы рассеяния для всех индивидуальных значений средней интенсивности, чтобы отразить вариабельность между клетками при каждом условии. Представление данных об интенсивности таким образом полезно, так как оно позволяет быстро сравнить результаты обработки и наглядно демонстрирует значительную неоднородность популяции клеток при данной обработке, которая в противном случае была бы скрыта при использовании стандартных способов представления данных. В качестве альтернативы постройте столбчатые диаграммы для отображения средней интенсивности плюс стандартное отклонение нативной РНК, чтобы количественно определить общий синтез РНК; затем клетки U2 OS, подвергнутые воздействию гипоксии и культивируемые в присутствии 5-этинил-уридина или EU, были обработаны и проанализированы.

Как показано в данном видео, интенсивность флуоресценции всех клеток в каждой исследуемой популяции была усреднена и представлена на графике. В этой столбчатой диаграмме для расчета статистической вероятности значимого отличия каждой опытной группы от контрольной использовался t-критерий Стьюдента. Примечательно, что эти данные свидетельствуют о статистически значимом увеличении общего синтеза РНК с течением времени.

При воздействии гипоксии на клетки U2 OS в течение более полутора часов, как и ожидалось, обработка актиномицином D полностью устраняет интенсивность флуоресценции. Эти данные свидетельствуют о том, что после более длительных периодов гипоксии клетка сосредоточивает свои ресурсы на синтезе РНК даже в этой агрессивной гипоксической среде. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как маркировать и количественно определять синтезируемую РНК на уровне отдельных клеток в условиях гипоксии и нормоксии; при должном навыке выполнение данной процедуры занимает два часа.

Для определения того, изменился ли уровень РНК-полимеразы и активирован ли HIF, можно использовать другие методы, такие как совместное окрашивание антителами к РНК-полимеразе и HIF. Не забывайте, что работа с формальдегидом при выполнении данной процедуры может быть крайне опасной. Обязательно используйте перчатки и работайте в вытяжном шкафу.