Восстановление β-катенина ухудшение Xenopus Яйцо Экстракт

Метод описан для анализа деградацию белков с использованием, меченные радиоактивным изотопом и люциферазы-слитые белки в Xenopus экстракта яичного и его адаптации для высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторов деградации белков.

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании бесклеточной биохимической системы экстракта яиц ксенопуса для анализа бета-катина в обороте. Это достигается путем первого добавления и/или истощения предполагаемых эффекторов к активированному экстракту яйца xip с целью идентификации модуляторов оборота бета-катенина в качестве второго этапа: транскрибируемый и транслируемый бета-катенин in vitro, либо радиомеченный S 35, либо слитый с люциферазой, добавляется к экстракту яйца XUS, который активно разлагается в нативных условиях. Затем соберите временные точки, чтобы оценить изменения уровня бета-катина и белка с течением времени.

Получены результаты, которые показывают, увеличивает или уменьшает конкретная модуляция экстракта яиц ксенопуса скорость бета-катина и деградации на основе авторентгенографии и/или обнаружения люминесценции. Преимущество этого метода по сравнению с другими существующими методами, такими как эксперименты с погоней за пульсом или циклической погоней Хейде на культивируемых клетках, заключается в том, что экстракт яйца ксенопуса обеспечивает бесклеточную биохимическую систему, в которой можно анализировать регуляцию белка на белковом уровне, и ему не хватает дополнительной сложности активной транскрипции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигнала путем идентификации регуляторов ключевых сигнальных белков, таких как бета-катина.

Работа с экстрактом ксенопуса позволяет пользователю легко истощать компоненты пути и добавлять обратно определенное количество белка. Чтобы определить его дозозависимые эффекты, используйте свежеприготовленный экстракт яйца XUS или быстро разморозьте, замороженный экстракт и положите на лед. Все манипуляции выполнять на холоде, приготовьте гранулированное антитело или аффинные шарики на одну 10-ю объема экстракта, чтобы свести к минимуму разведение экстракта, перед добавлением экстракта извлеките из шариков как можно больше жидкости.

С помощью гелевых насадочных наконечников с длинными коническими концами экстракт добавляется в связующую смолу GST. Вращайте смесь экстрактов при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа. Затем вращайте смесь экстрактовых шариков при 12 600 G в микрофуге при четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд.

Будьте осторожны, чтобы не переложить бусины вместе с экстрактом. Переложите истощенный экстракт в свежую микропробирку со льдом. Подтвердите эффективность истощения с помощью иммуноблоттинга, как истощенного экстракта, так и гранул

Поскольку Т и деградация зависят от энергии, они быстро истощают эндогенные запасы А ТП. Следовательно, для поддержания устойчивой деградации тестостерона необходимо использовать смесь для регенерации энергии. Приготовьте 20-кратную регенерацию энергии или смесь ER, как описано в текстовом протоколе.

Быстро разморозьте экстракт яйца опуса, потерев замороженную трубочку между ладонями. Поместите тюбик на лед непосредственно перед тем, как весь экстракт растает. Добавьте 10 микролитров для регенерации энергии.

Смешайте с аликвотой экстракт яйца ксенопуса. Тщательно перемешайте, быстро щелкнув трубкой и пульсируя, закрутите пульс и сразу же положите на лед. Распределите соответствующие объемы для анализа деградации в предварительно охлажденные микрофуговые пробирки на льду.

Чтобы подготовиться к радиометаническому бета-катину и анализам деградации, возьмите от двух до пяти микролитров экстракта для каждого временного момента, чтобы выполнить радиометеный анализ деградации бета-катенина в экстракте яйца XUS. Во-первых, приготовьте радиосигнал с меткой бета-катенин, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте от одного до трех микролитров транслированного бета-катенина in vitro к 20 микролитрам реакционной смеси xip на лед тщательно перемешайте быстрым движением пробирки и коротким импульсом вихря.

Это важный шаг. Экстракт яйца XUS очень вязкий, и неполное смешивание повлияет на консистенцию результата: пульсируйте, отжимайте и помещайте на лед. Запустите реакцию деградации бета-катенина, переместив пробирки на комнатную температуру в назначенный момент времени.

Удалите от одного до пяти микролитров образца и немедленно смешайте с пятикратным объемом буфера для образцов SDS, чтобы остановить реакцию и убедиться, что реакция разложения полностью завершена. Прокрутите трубку несколько раз и энергично похлопайте, чтобы выполнить страницу SDS. Авторентгенография запускает один микролитровый эквивалент экстракта для каждой временной точки на полосу.

Результаты могут быть количественно оценены с помощью изображения, J-квантового изображения или другого предпочитаемого программного обеспечения для обработки изображений. О деградации бета-катенина в экстракте яйца xap должно свидетельствовать зависящее от времени снижение интенсивности радиомеченного бета-каина в полосе. Для получения бета-катенина люциферазы синтезируют нерадиоактивно меченую люциферазу, меченную бета-катенином.

Использование транскрипционной трансляции сопряженной системы с полной смесью аминокислот. Подтвердите продукцию меченного люциферазой бета-катенина путем измерения активности люциферазы от 0,5 до одного микролитра реакции. Оцените фоновую люминесценцию путем измерения люминесценции из нетранслируемой реакционной смеси для проведения анализа деградации бета-катин-люциферазы Сначала разморозьте и приготовьте экстракт яйца ксенопуса, как и раньше.

Затем добавьте in vitro трансляцию бета-катина и люциферазы в приготовленную реакцию xip. Перемешайте на льду и хорошо перемешайте. Как и раньше, переместите экстракт до комнатной температуры, чтобы запустить реакцию разложения.

Удалите аликвоту реакции в указанный момент времени и заморозьте в жидком азоте. Удаляйте тройные образцы для анализа в каждый момент времени. Замороженный экстракт можно хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к анализу.

Разморозьте образцы на льду и перенесите образцы в стандартные белые 96 луночные планшеты на льду перед обработкой. Что касается активности люциферазы, то трехзависимая деградация бета-катенина от GS GSK может быть легко продемонстрирована различными способами с использованием экстракта яйца XUS. Деградация радиометеного бета-катенина S 35 в экстракте XUS ингибируется добавлением ингибитора протеасом MG 1 32.

Мутантный бета-катенин стабилизируется в экстракте яйца XUS по сравнению с бетаином дикого типа, а три ингибитора белка GSK аналогичным образом ингибируют деградацию бета-катенина. Наконец, истощение GSK 3 из экстракта яйца xip ингибирует деградацию бета-катенина, что может быть предотвращено добавлением экзогенного GSK 3. Для оценки деградации бета-катина и люциферазы использовали анализ деградации бета-катенина люциферазы в экстракте яиц xip.

Скорость деградации бета-катина и люциферазы аналогична немеченному белку бета-катенина. Регуляция деградации при слиянии бета-катина и люциферазы по существу идентична регуляции белка без слияния. Поскольку добавление хлорида лития приводило к ингибированию бета-катина и люциферазного оборота, изменения радиоактивного сигнала бета-катины.

Белок люциферазы параллелен изменениям ферментативной активности люциферазы с течением времени при попытке проведения этой процедуры. Важно держать все реагенты на льду и тщательно перемешать реакции, прежде чем приступать к этому анализу. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как идентифицировать регуляторы и анализировать бета-катин и оборот с помощью бесклеточной системы экстракта яиц ксенопуса.