Name: RNAscope для В месте Обнаружение транскрипционно активны вируса папилломы человека в головы и шеи Плоскоклеточный рак (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Узнайте метод RNAscope для обнаружения транскрипционно активного ВПЧ в плоскоклеточном раке головы и шеи. Этот подход позволяет визуализировать мРНК E6/E7 с чувствительностью до одной молекулы в парафиновых срезах.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Частично поддержана NIH грант (R43/44CA122444) и DOD BRCP гранта (W81XWH-06-1-0682) до Ю.Л..

1. Образец, оборудование, и о подготовке реагентов <ol><li> Cut образец ткани на блоки 3-4 мм в толщину, фиксируют в пресной 10% нейтральном забуференном формалине-за 16-32 ч при комнатной температуре (25 ° C) и вставить в парафин. Вырезать FFPE на секции толщиной 5 ± 1 мкм от FFPE блоков, смонтировать разделы, посвященные горками и высохнуть на воздухе. Примечание: Слайды можно хранить при комнатной температуре в атмосфере высыхания до 3 месяцев. Установленные горки ткани должны быть запеченный в сухом над при 60 ° С в течение 1 часа до анализа RNAscope. </li><li> Принесите гибридизации духовку до 40 ° С. Поставьте Увлажнение бумаги в лотке контроля влажности. Добавить 50 мл дН 2 O в Увлажняющий бумаги мочить его полностью. Вставьте покрытый лоток в печь, чтобы prewarm по крайней мере 30 минут перед использованием. </li><li> Сделать 700 мл 1x предварительной обработки 2 Решение (10 NL, рН 6 цитрат буфер) путем разбавления 10x предварительной обработки раствора в дН 2 O. Нагрейте 1x предварительной обработки 2 решение до кипения и почтаntain температуру между 100-104 ° С, не допуская чрезмерного кипения. </li><li> Сделать 3 L 1x промывочного раствора (0,1 x SSC) путем разбавления нагретого 50x промывочного буфера в дН 2 O. </li><li> Подготовка 2 х 200 мл ксилола и 2 х 200 мл 100% этанола для депарафинизации в вытяжном шкафу. </li><li> Подготовка 50%-ный раствор окраска гематоксилином и расточительность реагента (0,01% водный раствор аммиака) для последующей окраски под вытяжкой. </li><li> Подготовка 200 мл ксилола, 200 мл 70% и 2 х 200 мл 100% этанола для обезвоживания в вытяжном шкафу. </li><li> Prewarm целям зонды при 40 ° С в течение 10 мин и приносят обнаружения RTU набора реагентов до комнатной температуры, в том числе RTU Amp1, AMP2, AMP3, AMP4, Amp 5-Браун, и АМР6-Браун, кроме DAB хромоген Brown-А и Brown-B . </li></ol> 2. RNAscope Анализ Депарафинирование и обезвоживание После выпечки deparaffinize срезах тканей в ксилоле в течение 2 х 5 мин при частом помешивании, и обезвоживаютв 100% EtOH в течение 2 х 3 мин при частом помешивании. Воздух сухой в течение 5 мин и нарисуйте гидрофобный барьер вокруг срез ткани с гидрофобный барьер Pen. Предварительной обработки <ol><li> Выдержите срезах тканей с предварительной обработки 1 в течение 10 мин при комнатной температуре для тушения эндогенного активности пероксидазы, промыть в дН 2 O. </li><li> Инкубируйте срезов ткани с предварительной обработки 2 поддерживают при температуре кипения в течение 15 мин для извлечения РНК, промыть дважды в дН 2 O. </li><li> Выдержите ткани секции с предварительной обработки 3 в течение 30 мин при 40 ° С в течение переваривания белков в HybEZ печи, промыть дважды в дН 2 O. </li></ol> Целевая зонд Гибридизация Целевые HPV-зонды HR 7 бассейн включают: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58. Добавить ВПЧ зондов, Убиквитин C (UBC) и бактериальных генов dapB зонды отдельно на три секции рядом тканей. Гибридизации при 40 ° С в духовке в течение 2ч, затем промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре. Усиление сигналов <ol><li> Инкубируйте срезов ткани с Amp1 (предусилителя) в течение 30 мин при 40 ° С, Amp2 (фон редуктор) в течение 15 мин при 40 ° С, AMP3 (усилитель) в течение 30 мин при 40 ° С и AMP4 (метка зонд) в течение 15 мин при 40 ° С в HybEZ печи. После каждой стадии гибридизации, промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре. </li><li> Инкубируйте срезов ткани с AMP5 в течение 30 мин и АМР6 в течение 15 мин при комнатной температуре. После каждой стадии инкубации промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре. </li></ol> Обнаружения сигнала Инкубируйте срезов ткани с 1:01 DAB смеси путем смешивания равный объем Brown-А и Brown-B в течение 10 мин при комнатной температуре, промыть дважды в дН 2 O. Контрастного <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Пятно срезы ткани с 50%-ным раствором гематоксилин в течение 2 мин при комнатной температуре, промыть дН 2 O до горки не ясны, пока ткани остаются фиолетовый. Dip слайды в 0,01% аммиака в дН 2 O для 5х и последовал с 5 провалов в дН 2 O. Презентация монтажа Дегидрировать срезах тканей в 70%, 100% и 100% этанола в течение 2 мин каждый, ксилол в течение 5 мин, крепление с ксилола на основе монтажных СМИ.

<ol><li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li>
<li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Payne, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+circulating+tumour+cell+detection+using+multiplex+RNA+in+situ+hybridisation+predicts+progression-free+survival+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients.</a> Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Bordeaux, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+%28HER2%29+status+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li>
<li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li>
<li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+human+papillomavirus+E6%2FE7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal%2Fhypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%3A+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Schache AG,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li>
<li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck%3A+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol.+Jun%22%5BJournal%5D)">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li>
<li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li>
<li>Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHammond%2C+ME+%22Arch.+Pathol.+Lab.+Med%22">Arch. Pathol. Lab. Med</a>. 134 (7), 48-72 (2010).</li>
</ol>

Все авторы являются сотрудниками и самостоятельно складе в Advanced Cell Диагностика, Inc

Анализ RNAscope ВПЧ позволила прямой визуализации Е6/Е7 мРНК на месте в ВПЧ-ассоциированных головы и шеи плоскоклеточный рак. RNAscope анализ полностью совместим с фиксированной регулярно опухолевой ткани и сохраняет ткани морфологию для гистопатологическими корреляций (рис. 2). Ключевым преимуществом RNAscope анализа по сравнению с традиционными методами CISH том, что он специально усиливает сигналов гибридизации (рис. 2В и 2E) без усиления фонового шума (рис. 2C и 2F). На практике процедура анализа RNAscope ВПЧ может быть завершена в течение 8 ч или удобно разделить в течение двух дней. Анализ RNAscope HPV был использован для определения состояния HPV в головы и шеи плоскоклеточного рака 12-16, демонстрируя 97% чувствительность и 93% специфичность с использованием Qrt-ПЦР в качестве опорного метода 16. Обычные CHRomogenic ISH для HR-ДНК ВПЧ обладает высокой специфичностью, но имеет чувствительность ~ 80% 12. Иммуногистохимический (IHC) окрашивание на клеточном суррогатным маркером p16 демонстрирует превосходную чувствительность, но может генерировать ложные положительные результаты 15,18, особенно в nonoropharyngeal головы и шеи рака 15. Текущий метод &quot;золотым стандартом&quot; Qrt-ПЦР для HPV Е6/Е7 обнаружения мРНК требуется свежезамороженной ткани для достижения оптимальных результатов и является технически сложной, что ограничивает его применение только научно-исследовательской лаборатории. Кроме того, он требует экстракции РНК что делает невозможным соотнести выражение HR-HPV мРНК Е6/Е7 с гистопатологией. Есть несколько важных факторов для успеха анализа RNAscope. Во-первых, для получения лучших результатов, ткани должны быть зафиксированы в свежем 10% нейтральном забуференном формалине при комнатной температуре в течение 16-32 ч в соответствии с ASCO / CAP принципов 19. Во-вторых, печь HybEZ настоятельно рекомендуется, так как это позволиты оптимальное управление температурой и влажностью для гибридизации зонда и стадий амплификации сигнала. В-третьих, важно, чтобы удалить лишние остаточные буферы перед каждым шагом, но по-прежнему держать срезы ткани от высыхания во время любой из этих шагов. Ручная процедура RNAscope описано здесь был полностью автоматизирован на слайд системы коммерческого авто-окрашивания 10. Это должно значительно облегчить стандартизацию условий анализа и экономя драгоценное ручного труда в клинических лабораториях патологии. Кроме того, программное обеспечение, предназначенное для анализа изображений была разработана 10 для автоматической идентификации клеток и окрашивания сигналы на цифровом слайд, который должен помочь устранить субъективность и улучшить воспроизводимость в выигрыше. Таким образом, анализ RNAscope ВПЧ обнаруживает присутствие ВПЧ-ВР Е6/Е7 транскриптов мРНК на месте в FFPE тканей. Он имеет рабочий процесс, знакомый клинической патологии лабораторнойтории по позволяя непосредственно визуализацию их в срезах тканей. Он предлагает идеальную платформу для изучения (FFPE) образцов ткани, и может быть легко принят диагностических лабораториях патологии.

Высокого риска вирусом папилломы человека (ВПЧ-ВР) инфекции составляет примерно 5% всех случаев рака во всем мире 1. Заболеваемость ВПЧ-ассоциированных рака ротоглотки увеличилось в течение последних десятилетий, особенно среди мужчин. ВПЧ-положительных ротоглотки плоскоклеточный рак (OPSCC), скорее всего, составляют большинство всех головы и шеи рака в Соединенных Штатах в течение следующих 20 лет 2. Ротоглоточные плоскоклеточный рак, вызванных ВПЧ связаны с благоприятной выживания, и статус опухоли ВПЧ является сильным и независимым прогностическим фактором для выживания 3. Доказательства активации транскрипции вирусных онкогенов Е6 и Е7 рассматривается как золотой стандарт для присутствии клинически значимых ВПЧ 4. Однако обнаружение мРНК Е6/Е7 из свежей опухолевой ткани с помощью RT-PCR техники не практично в обычной клинической практике и была ограничена научно-исследовательских лабораторий. В последнее время мы ВГАэ разработали новый РНК ISH технологию RNAscope, что позволяет мультиплекс обнаружения в отдельных клетках с чувствительностью одной молекулы РНК в фиксированных формалином и залитых в парафин образцов ткани (FFPE) 5-10. Мы предоставили три линии доказательств для обнаружения отдельных молекул 5. Во-первых, дизайн и сигнал Системы звукоусиления RNAscope зонд позволило выявить одну копию HER2 геномных мишеней ДНК в HeLa и SK-BR-3 клеточных линий. Во-вторых, по сравнению с HER2 геномных ДНК сигналов, распределение флуоресцентных интенсивностей сигналов HER2 мРНК точек в клетках HeLa согласуется с одной молекулой в точку. В-третьих, количество HER2 мРНК сигнала точек на клетки соответствуют тесно количество HER2 мРНК копирования стоимости раствором на основе количественного анализа, что также подтверждает обнаружение одной молекуле. Кроме того, контрастного ядер с DAPI в флуоресцентной микроскопии или с гематоксилином в ярко-микроскопии позволяет визуализировать отдельных ядер, белыйич в свою очередь позволяет обнаружение и количественное определение РНК-мишеней на одноклеточных основе 10. Умение анализировать экспрессию генов на месте в обычных клинических образцов делает RNAscope перспективной платформой для диагностики патологии, особенно те ​​FFPE ткани раздел основе анализов 10,11. Мы разработали RNAscope основе ВПЧ анализа для обнаружения мРНК Е6/Е7 из семи высокого риска генотипов ВПЧ (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58) с использованием пул генотипа конкретного зондов. Наши недавние исследования в OPSCC показали, что анализ RNAscope ВПЧ является высокой чувствительностью и специфичностью в определении статуса ВПЧ на FFPE тканей 12-17, а также информирует прогноз в OPSCC 12,16. Принцип технологии RNAscope было описано ранее 5. Здесь мы описываем полный протокол RNAscope анализа и продемонстрировать его использование в обнаружении ВПЧ-ВР в FFPE секциях опухолевой ткани.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus слайды</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Oven, Tray, and Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58, E6/E7 mRNA</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Гидрофобная барьерная ручка</td> векторная <td>лаборатория</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Американский Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Аммиак гидроксид</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Крышка стекла 24 мм x 50 мм</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Горячая плита</td><td>Сушильная</td> печь <td></td> Fisher Scientific 11-300-49SHP <td></td></tr><tr><td></td> Способна выдерживать температуру 60°М;<td></td><td></td><td> 1 &deg; C</td></tr><tr><td>Водяная баня</td><td></td><td></td><td>Способна поддерживать температуру на уровне 40&m; 1 &deg; С</td></tr></tbody></table>

rnascope для<em&gt; В месте</em&gt; Обнаружение транскрипционно активны вируса папилломы человека в головы и шеи Плоскоклеточный рак

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

«Золотым стандартом» для онкогенных обнаружения ВПЧ является демонстрация транскрипционно активного ВПЧ высокого риска в опухолевой ткани. Тем не менее, обнаружение Е6/Е7 мРНК с помощью количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (Qrt-ПЦР) требует выделения РНК, которая разрушает контекст ткани опухоли решающее значение для морфологической корреляции и был трудно быть приняты в повседневной клинической практике. Наш недавно разработала РНК гибридизация технологии, RNAscope в, позволяет прямой визуализации РНК в фиксированных формалином, парафин (FFPE) ткани с чувствительностью одной молекулы и разрешения одной клетки, что позволяет высокую чувствительность и специфичность на месте анализа любого РНК биомаркеров в обычных клинических образцов. Анализ RNAscope ВПЧ был предназначен для обнаружения мРНК Е6/Е7 из семи высокого риска ВПЧ генотипов (ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58), используя пул генотипа конкретного зондов. Он продемонстрировал высокую чувствительностьи специфичность в отношении текущего метода &#39;золотой стандарт&#39; обнаружения мРНК Е6/Е7 по Qrt-PCR. Статус ВПЧ определяется RNAscope сильно прогностическим из клинического исхода в ротоглотки больных раком.

RNAscope ВПЧ анализ рабочего процесса RNAscope анализ имеет весьма рационализировать рабочий процесс, который похож на IHC (рис. 1). Она состоит из четырех основных этапов: предварительная обработка, гибридизации, сигнальные Амплификации, и обнаружения. Он использует уникальный дизайн стратегию зонда, что обеспечивает высокую точность усиление сигнала 5. В анализе RNAscope HPV, семь HR-HPV зондов наборы объединяют, все признана той же системе амплификации сигнала, связанного с пероксидазой хрена (HRP). Конкретные сигнала гибридизации обнаружен как коричневый осадок, образованные HRP катализируемой реакции с использованием хромогенного DAB в качестве субстрата, который может быть легко визуализировать с помощью стандартного светлом поле микроскопа. Представитель окрашивание для обнаружения ВПЧ На рисунке 2 показан пример изображения из цветного FFPE разделах головы и шеи плоскоклеточный рак. В ВПЧ-положительных случае (рис.Юр 2А), в HR-HPV зонды обнаружены сильные сигналы точечные специально в опухолевых клетках. UBC зонд обнаружены многочисленные точечные цитоплазматические сигналов в обоих опухолевых клеток и стромальных клеток (фиг. 2b). Бактериальным геном dapB зонд продемонстрировали чистый фон (рис. 2в). В случае ВПЧ-отрицательных, как зонд ВПЧ-ВР и зонд dapB не обнаружили сигналы (Цифры 2D и 2F), в то время как сильные сигналы были обнаружены с помощью зонда UBC (Рисунок 2E). В этом анализе UBC служит в качестве положительного контроля для оценки качества тканей РНК и dapB в качестве отрицательного контроля для фоновых сигналов. Счет в матче на определении статуса ВПЧ включает изучение всех трех слайды для каждого конкретного случая. Уровень окрашивание на отрицательной контрольной слайда (dapB) слайд используется в качестве отсечки: HPV положительность определяется наличием точечной цитоплазматической и / или атомной окрашивания, которая была выше сигнала на слайде dabpB. <pкласс = &quot;jove_content&quot; FO: держать-together.within-страницу = &quot;всегда&quot;&gt; <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Рисунок 1. Блок-схема RNAscope анализа. Иллюстрация RNAscope анализа рабочего процесса. RNAscope анализ содержит 4 основных шагов, предварительной обработки, цель зонда гибридизации, усиление сигнала и обнаружение сигнала. Вся процедура анализа может быть завершена в 8 часов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a> <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Рисунок 2. Пример изображения RNAscope окрашенных слайды. FFPE срезах, окрашенных зондов для ВПЧ-ВР, UBC (положительный контроль) и dapB (отрицательный контроль)от двух случаях ПРГШ. переменного тока. ВПЧ-положительных случай. , ВПЧ-ВР Е6/Е7 экспрессии мРНК в клетках опухоли. Вставка, 40-кратном увеличении, чтобы показать точечные сигналы. В и С) смежные секции ткани не показывая положительный UBC окрашивание (В) и отрицательным для dapB (С), соответственно. DF) ВПЧ-негативных случай. D) не окрашивание на ВПЧ Е6/Е7 мРНК , похож на отрицательного контроля dapB (F). Е) UBC положительное окрашивание. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a>

Наличие ВПЧ высокого риска в головы и шеи опухолевой ткани связано с благоприятными результатами. Недавно разработанная РНК в технике гибридизация называется RNAscope позволяет прямой визуализации ВПЧ Е6/Е7 мРНК в секциях FFPE ткани.

RNAscope для<em&gt; В месте</em&gt; Обнаружение транскрипционно активны вируса папилломы человека в головы и шеи Плоскоклеточный рак

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать чувствительное и специфическое обнаружение мРНК E6 и E7 ВПЧ высокого риска в опухолевых клетках при раке головы и шеи с использованием нового метода гибридизации РНК in situ, называемого RNAscope. Это достигается путем предварительной обработки образцов тканей на предметных стеклах с помощью нагрева и протеазы для пермеабилизации клеток с целью обеспечения доступа зондов. На втором этапе предметные стекла инкубируют с коктейлем зондов на ВПЧ, нацеленным на семь типов ВПЧ высокого риска, которые гибридизуются с мРНК E6 и E7.Затем усильте сигналы гибридизации путем последовательной гибридизации с преамплификатором, амплификатором и меткой-зондом, конъюгированной с HRP. После этого сигнал детектируют с помощью хромогена и визуализируют с использованием стандартной микроскопии в светлом поле; в результате получаются данные, демонстрирующие сигналы мРНК HPVE six E seven в виде точечных коричневых преципитатов в HPV-положительных опухолях, но не в HPV-отрицательных опухолях. В анализе RRA scope используется новая запатентованная стратегия разработки зондов для обеспечения гибридизации.Данный метод позволяет визуализировать отдельные молекулы и проводить количественную оценку мишеней. Эта технология открывает исследователям в области поиска биомаркеров и разработки средств диагностики возможность идентифицировать и валидировать любые РНК-биомаркеры, обнаруженные с помощью методов macro-RACE или секвенирования следующего поколения. Большинство ученых, имеющих опыт работы с ИГХ или ISH, смогут быстро освоить данный метод.Теперь я продемонстрирую вам весь рабочий процесс, осветив ключевые этапы, чтобы помочь вам освоить эту методику. Образцы тканей, предназначенные для анализа методом гибридизации РНК in situ, предварительно фиксированы формалином. Срезы, залитые в парафин, толщиной 5 ± 1 мкм, наносятся на предметные стекла за один час до начала анализа.Просушите стекла в сушильном шкафу при температуре 60 °C. Подготовьте печь для гибридизации: установите температуру 40 °C и поместите увлажняющую бумагу в лоток для контроля влажности.Добавьте 50 milliliters дистиллированной воды к увлажняющей бумаге, чтобы полностью ее смочить. Поместите закрытый лоток в печь для предварительного прогрева минимум на 30 минут перед использованием. Приготовьте 700 milliliters 1x раствора pretreat two, разбавив 10x раствор для предварительной обработки дистиллированной водой.Нагрейте раствор для предварительной обработки 1x до кипения и поддерживайте температуру в диапазоне от 100 до 104 °C, не допуская чрезмерного кипения. Приготовьте три литра промывочного буфера 1x, разбавив предварительно нагретый промывочный буфер 50x дистиллированной водой в вытяжном шкафу.Подготовьте ксилолы, 70% этанол и 100% этанол для завершения депарафинизации и дегидратации. Приготовьте 50% раствор гематина для окрашивания и 0,01% раствор аммиака или голубящий реагент для постокрашивания. Предварительно прогрейте целевые зонды при 40 °C в течение 10 минут.Доведите все реагенты набора для детекции RTU до комнатной температуры, за исключением хромогена DAB brown A и brown B. Для начала анализа депарафинизируйте высушенные срезы тканей в ксилоле дважды по пять минут с частым перемешиванием. Дегидратируйте в 100% Ethanol дважды по три минуты с частым перемешиванием.Высушите на воздухе в течение пяти минут, затем с помощью гидрофобного маркера создайте гидрофобный барьер вокруг среза ткани. Начните предварительную обработку срезов тканей, инкубируя их в растворе pretreat one в течение 10 минут при комнатной температуре. Это позволит подавить активность эндогенной пероксидазы.Промойте в дистиллированной воде. Затем извлеките РНК, инкубируя срезы тканей в течение 15 минут в растворе для предварительной обработки №2, поддерживая температуру кипения; через 15 минут дважды промойте в дистиллированной воде для переваривания белков. Обработайте срезы тканей раствором для предварительной обработки №3 и инкубируйте в гибридизационном печи при 40 °C в течение 30 минут.По завершении 30-минутной инкубации дважды промойте срезы ткани дистиллированной водой. Следующим этапом является гибридизация с зондами к мишеням, используя пул зондов, которые определяют мРНК E6 и E7 семи генотипов ВПЧ высокого риска: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58. Добавьте зонды к HPV, зонд к убиквитину C и зонд к бактериальному гену DAP B по отдельности на три соседних среза ткани.После завершения двухчасовой инкубации проведите гибридизацию в печи при 40 °C в течение двух часов. Для усиления сигнала дважды промойте срезы тканей в промывочном буфере по две минуты каждый раз при комнатной температуре. Начните с инкубации срезов тканей с преамплификатором AMP one в течение 30 минут при 40 °C в гибридизационной печи.Промойте дважды в промывочном буфере по две минуты каждый раз при комнатной температуре. Последующие этапы усиления сигнала включают инкубацию срезов ткани со следующими реагентами при 40 °C в течение указанного времени с двумя промывками в промывочном буфере при комнатной температуре. После каждой инкубации используйте AMP two background reducer в течение 15 минут.Инкубируйте с усилителем AMP три в течение 30 минут и с меченым зондом AMP четыре в течение 15 минут. Затем, после двух промывок в промывочном буфере, инкубируйте срезы ткани с amp пять в течение 30 минут при комнатной температуре, затем инкубируйте с amp шесть в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего повторите две промывки в промывочном буфере. Для детекции сигнала приготовьте смесь DAB в соотношении один к одному, смешав равные объемы компонентов Brown A и Brown B. Нанесите раствор на предметные стекла и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.Дважды промойте в дистиллированной воде. Проведите докрашивание срезов ткани 50% раствором гематоксилина в течение двух минут при комнатной температуре, затем промойте дистиллированной водой до тех пор, пока стекла не станут прозрачными, а ткани останутся пурпурными. Пять раз погрузите стекла в 0,01% раствор аммиака, после чего пять раз погрузите их в дистиллированную воду. Дегидратируйте срезы ткани, инкубируя их по две минуты в 70% этаноле, 100% этаноле и снова в 100% этаноле, после чего выдержите в ксилоле в течение пяти минут.Наконец, закройте стекла с использованием смолы на основе ксилола. Здесь представлены примеры изображений окрашенных срезов головы и шеи с плоскоклеточным раком, зафиксированных в формалине и залитых парафином. В случае HPV-положительного образца зонды на HR HPV выявили сильные точечные сигналы именно в опухолевых клетках. Это отчетливо видно на вставке при 40-кратном увеличении.Положительный контрольный зонд UBC выявил многочисленные точечные цитоплазматические сигналы как в опухолевых, так и в стромальных клетках. В то время как отрицательный контрольный зонд DAP B продемонстрировал чистый фон в случае, отрицательном по HPV, при отсутствии сигналов от зонда HR HPV и зонда DAP B зонд UBC выявил сильные сигналы. Определение статуса HPV предполагает анализ всех трех слайдов для каждого случая.Уровень окрашивания на контрольном стекле DAP B с отрицательным контролем используется в качестве порогового значения; положительный результат на HPV определяется наличием точечного цитоплазматического и/или ядерного окрашивания, интенсивность которого превышает сигнал на стекле DAP B. При правильном выполнении анализ RNAscope может быть завершен в течение восьми часов. На каждом этапе крайне важно добавлять достаточное количество раствора, чтобы полностью покрыть всю область ткани.Также важно удалять остатки буфера, встряхивая предметные стекла между этапами, при этом стараясь сохранить их в чистоте. Технология rescope может быть применена для детектирования практически любых РНК-биомаркеров в любых клетках или тканях любого вида.

rnascope-for-situ-detection-transcriptionally-active-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Характеристика T-клеточных эпитопов патогенов, вызывающих локальные инфекции, таких как вирус папилломы человека, представляет собой сложную задачу из-за ограниченного количества циркулирующих T-клеток. В данной работе описан метод, с помощью которого редкие T-клетки были изолированы и охарактеризованы, исходя из очень малого количества исходных клеток.

Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека

Это видео описывает стратегию последовательной гибридизации, которая включает в себя гибридизацию зондов мРНК мРНК с определенной мишенью. После гибридизации зондов проводится усиление сигнала для повышения разрешения за счет снижения отношения сигнал/шум во время РНК-CISH гистологических образцов.

Зондовая гибридизация и амплификация сигнала в РНК in situ Hybridization: метод обнаружения специфических последовательностей РНК в срезах тканей

В этом видео представлен протокол обнаружения сигнала во время хромогенной гибридизации РНК in situ. Эта методика может быть использована для визуальной диагностики активной онкогенной инфекции в неповрежденном образце ткани.

Детектирование сигнала РНК CISH: метод обнаружения хромогенных сигналов во время гибридизации РНК in situ в образцах интактных тканей

Человека эндогенные ретровирусы (HERV), которые занимают 8% человеческого генома, сохранить скудные возможности кодирования, но сто тысяч длинные повторы терминала (л). Пользовательский Affymetrix микрочипов был разработан, чтобы определить индивидуальное выражение HERV локус и был использован на ткани рака простаты, как доказательство концепции для будущих клинических исследований.

Микрочипов на основе идентификации отдельных HERV Loci выражение: применение к биомаркеров при раке простаты

Многопараметрическую флуоресцентную иммуногистохимию можно использовать для оценки количества, относительного распределения и локализации популяций иммунных клеток в микроокружении опухоли. В этой рукописи описывается использование этой методики для анализа субпопуляций Т-клеток при раке ротоглотки.

Четырехцветная флуоресценция Иммуногистохимия субпопуляций Т-клеток в архивных формалиновых фиксированных, парафиновых встраиваемых образцах проксимальной клеточной карциномы человека

Гомеобокс, регуляторных генов часто ассоциируется с опухолями в взрослых организмов. Мы исследовали их сравнительного выражения иммуногистохимических и анализ в реальном времени PCR, в нормальных и воспалительных носовой mucosae и придаточных пазух носа новообразования для того, чтобы использовать их в качестве возможных диагностических и терапевтических целей.

Определение OTX1 и OTX2 как два возможных молекулярных маркеров для карциномы придаточных пазух носа и обонятельные нейробластомы

Здесь представлен протокол локализации легочных конкреций с использованием маркировки красителем с помощью электромагнитно управляемого трансторакального доступа к игле. Описанная здесь методика может быть выполнена в периоперационном периоде для оптимизации локализации узелков и успешной резекции при выполнении малоинвазивной торакальной хирургии.

Электромагнитная навигация Локализация трансторакальных узелков для минимально инвазивной торакальной хирургии

Здесь мы представляем воспроизводимый метод для разработки модели ортотопическая мышиных плоскоклеточный рак головы и шеи. Опухолей продемонстрировать клинически значимых Гистопатологические особенности заболевания, в том числе некроза, бедных дифференциации, узловой метастазов и иммунных инфильтрации. Опухоль подшипник мышей развивать клинически значимых симптомов, включая дисфагии, перемещение челюсти и потеря веса.

Intramucosal прививки плоскоклеточный рак клеток мышей для опухоли иммунной профилирования и оценки реакции лечение

Вирус папилломы человека (ВПЧ) РНК-хромогенная на месте гибридизация считается одним из золотых стандартов для активного обнаружения папилломавируса вируса человека в опухолях. Это позволяет визуализировать экспрессию ВПЧ E6-E7 mRNA с локализацией и полуколичественной оценкой его сигнала.

Хромогенные На ситу Гибридизация SS инструмент для ВПЧ связанных головы и шеи диагностики рака

РНК шпильки и петли могут функционировать в качестве праймеров для обратной транскрипции (RT) в отсутствие последовательности конкретных грунтовки, вмешиваясь в изучение перекрывающихся антисмысловых стенограмм. Мы разработали метод, способный выявлять РНК, специфичную для прядей, и мы использовали ее для изучения антисмыслового белка ВИЧ-1 ASP.

Обнаружение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Антисмысление белка (ASP) РНК Стенограммы у пациентов Strand-специфический RT-PCR

Узнайте метод RNAscope для обнаружения транскрипционно активного ВПЧ в плоскоклеточном раке головы и шеи. Этот подход позволяет визуализировать мРНК E6/E7 с чувствительностью до одной молекулы в парафиновых срезах.

RNAscope для

Больше видео