Полный кожи Дефект Модель для оценки васкуляризации биоматериалов В Vivo
28 августа 2014 г.
Васкуляризация является ключом к подходам в успешной тканевой инженерии. Поэтому, надежные технологии обязаны оценить развитие сосудистых сетей в ткани-конструкций. Здесь мы представляем простой и экономичный способ для визуализации и количественной оценки васкуляризации в естественных условиях.
Общая цель этой процедуры заключается в визуализации кровеносных сосудов в тканевых инженерных конструкциях. Это достигается путем создания стандартизированного полного дефекта кожи на спине мышей. Затем образец тканевого инженерного материала имплантируется в дефект кожи.
Затем, по окончании времени наблюдения, материал имплантируется и помещается в устройство транс-освещения. Наконец, фотографии сосудистой сетки с высоким разрешением получаются с помощью стандартной цифровой камеры. В конечном счете, сеть судов анализируется с помощью цифровой сегментации и количественной оценки с помощью программного обеспечения Vest Egg Tool.
Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как микроскопия, компьютерная томография или магнитно-резонансная томография, заключается в том, что позволяет вовремя и вызвать эффективную визуализацию и количественную оценку сосудистых процессов в биоматериалах, фокусируя все новые функциональные сосуды. Этот метод может дать представление о васкуляризации кожных заместительных материалов. Он также может быть применен к другим модельным организмам или для изучения васкуляризации в других органах.
Для начала используйте 12-миллиметровые биопсийные перфораторы для создания образцов каркасов, таких как из бычьих кожных заместителей на основе коллагена, вырезанных круглых кусочков сетки тетина диаметром 14 миллиметров для размещения под каждым каркасом. После обезболивания мыши, проверка глубины обезболивания щипком пальца ноги и удаление меха сзади согласно текстовому протоколу. Поместите животное в положение лежа и с помощью перманентного пера с тонким наконечником отметьте среднюю линию спины мыши.
Определите зону иссечения, которая находится не слишком далеко, чтобы животное не смогло снять каркас. С помощью 10-миллиметрового биопсийного перфоратора создайте круглые двусторонние дефекты, осторожно прижимая пунш к коже. Чтобы очертить область иссечения щипцами, аккуратно оторвите отмеченную кожу и хирургическими ножницами сделайте надрез вдоль отмеченного круга.
Если произошло кровотечение, используйте стерильную марлю, чтобы тщательно сжать область, чтобы освободить место для сетки «Титаника». Увеличьте расстояние между кожей и подлежащими тканями на границе раны еще на два-четыре миллиметра. Поместите сетку в дефект непосредственно на раневое ложе и под краями раны.
Затем поместите леса непосредственно над сеткой. Используйте от четырех до шести одинарных узлов для наложения швов на каркас, чтобы соседние края раны оставляли края немного над каркасом. Затем наложите прозрачную раневую повязку над дефектами, чтобы защитить каркас и при этом обеспечить контроль за областью раны.
Оценивают, оценивают общее состояние животного ежедневно путем контроля двигательной активности, массы тела, признаков боли, толерантности к перевязке и аутокалечению. Также следите за областью раны на предмет кровотечения, местных и системных признаков инфекции и положения повязки. После усыпления животного в нужный момент времени.
Согласно текстовому протоколу, используйте перманентный маркер для обозначения места иссечения, которое включает в себя каркасы. С помощью ножниц или скальпеля надрежьте кожу по отмеченным линиям путем тупого иссечения, отделите всю кожу, включая каркасы и сетку от подлежащих тканей, поместите растянутую вверх ногами ткань в чашку Петри. Чтобы визуализировать образец, поместите его на устройство транс-освещения.
В режиме макросъемки можно сфотографировать полные каркасы и участки нормальной кожи одинакового размера и сохранить изображения в формате TIFF для дальнейшего цифрового анализа. После загрузки программного обеспечения ves EQ откройте изображение и выберите интересующую область для анализа, нажав клавишу Backspace. Затем нажмите «Инвертировать».
Чтобы визуализировать сосудистую сеть белым цветом, выберите Изображение Усиление сосуда Фильтр гистерезис пороговое пороговое преобразование цилиндра и Рассчитайте усиление сосуда на всех предыдущих шагах. Прокрутите для увеличения и уменьшения изображения. Сегментируйте карту судна, выбрав первый порог или покрытие судна таким образом, чтобы каждый пиксель, хотя бы отдаленно похожий на судно, был помечен как судно.
Нажмите «Рассчитать». Чтобы просмотреть выбранный вариант, выберите второй порог или покрытие фона таким образом, чтобы только те пиксели, которые особенно похожи на сосуды, были помечены как сосуды. Чтобы рассчитать длину судов и общую площадь, которую они охватывают, нажмите на изображение, статистика изображений и статистика двоичных изображений.
Длину сосуда лучше всего оценить, предварительно утончив сосудистую сеть до ширины в один пиксель. Для этого перед расчетом перейдите к морфологическим фильтрам изображений и скелетированию. Отношение площади судна к длине судна дает значение размера судна в интересующем регионе.
При необходимости устраните артефакты, выбрав только интересующие вас сосуды. Щелкнув под режимом выделения, нажмите клавишу Backspace, чтобы скопировать выбранные сосуды в новое изображение. Наконец, проанализируйте нативный участок кожи по тем же параметрам, что и каркас, присвоив значение 100% нативной ткани, и соотнесите каркас с этим значением.
Например, если процент белых пикселей составляет 30% в нормальной ткани и 15% в каркасе, это представляет собой 50% васкуляризацию общей площади каркаса. Обратите внимание, что значения соответствуют всей площади изображения. Следовательно, необходимо скорректировать его в соответствии с областью выбранного региона, как показано здесь.
Через две недели после имплантации ткани трансиллюминация позволила четко визуализировать сосудистые структуры шириной до 30 микрометров в образце всей ткани, который включал как нативную ткань, так и имплантированные каркасы. Использование цифровой сегментации для анализа эксплантированной ткани показало уровни васкуляризации 62,28 плюс-минус 8,6% в скаффолде по сравнению с нативной кожей. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о создании воспроизводимых дефектов кожи и надежной фиксации биоматериала в ране.
После этой процедуры расширенная ткань может быть использована для дальнейшего анализа, такого как гистология или экспрессия РНК и белка.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод визуализации и количественной оценки васкуляризации в тканеинженерных конструктах. Использование стандартизированной модели дефекта кожи у мышей позволяет эффективно анализировать сосудистую сеть.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Биология сосудов
- Визуализация in vivo
Теоретические основы
- Васкуляризация имеет решающее значение для успешной тканевой инженерии.
- Необходимы надежные технологии для оценки сосудистых сетей.
- Существующим методам может не хватать экономической эффективности и простоты.
- Данное исследование направлено на устранение этих пробелов.
Цель исследования
- Для визуализации кровеносных сосудов в тканеинженерных конструктах.
- Для разработки экономически эффективного метода анализа сосудистой сети.
- Для углубления понимания процессов васкуляризации в тканевой инженерии.
Используемые методы
- Создание стандартизированного полнослойного дефекта кожи у мышей.
- Имплантация тканеинженерного материала в область дефекта.
- Использование устройства для транслюминационного освещения при визуализации.
- Фотосъемка сосудистой сети с высоким разрешением.
Основные результаты
- Успешная визуализация кровеносных сосудов в конструктах.
- Количественный анализ сосудистой сети с помощью цифровой сегментации.
- Использование программного обеспечения Vest egg tool для анализа.
- Демонстрация эффективности и экономичности данного метода.
Выводы
- Данный метод обеспечивает надежный способ оценки васкуляризации.
- Его можно применять в различных исследованиях по тканевой инженерии.
- Будущие исследования могут основываться на этом подходе для достижения улучшенных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежная количественная оценка васкуляризации биоматериалов является критически важным этапом для продвижения тканеинженерных конструкций к трансляционной и доклинической валидации. Данная модель полнослойного дефекта кожи обеспечивает прямую визуализацию с высоким разрешением и цифровую количественную оценку неоваскуляризации, что повышает прогностическую уверенность в эффективности скаффолда. Такой подход оптимизирует процесс снижения рисков на ранних стадиях и отбор перспективных кандидатов из портфеля биоматериалов, предназначенных для применения в регенеративной медицине.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверить гипотезы о васкуляризации в искусственно созданных каркасах.
- Обеспечивает функциональную валидацию проангиогенных модификаций или включенных биоактивных молекул.
- Способствует снижению биологических рисков за счет количественной оценки врастания сосудов in vivo.
- Обеспечивает сравнительный внутренний контроль благодаря дизайну с двусторонними ранами, что снижает межиндивидуальную вариабельность между животными.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые условия проведения анализов in vivo для оценки биоматериалов.
- Позволяет получать количественные данные с помощью цифровой сегментации и показателей покрытия сосудами.
- Поддерживает высокоразрешающий скрининг нескольких составов каркасов или стратегий биоактивации.
- Обеспечивает повторное использование платформы для итеративной оптимизации свойств васкуляризации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям регенеративной медицины и восстановления тканей, имеющим отношение к заболеваниям.
- Обеспечивает преемственность от этапа оценки скаффолдов на стадии открытия до доклинической валидации васкуляризации.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе количественных показателей васкуляризации.
- Позволяет проводить последующие анализы, такие как гистология или молекулярное профилирование эксплантированной ткани.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Эта модель служит связующим звеном между этапом ранних открытий и доклинической оценкой, обеспечивая стандартизированный рабочий процесс для оценки васкуляризации биоматериалов in vivo.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез об ангиогенном потенциале и задействованных сигнальных путях в инженерных конструкциях.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимое количественное сравнение вариантов скаффолдов и подходов к биоактивации.
- Аналитика: Предоставляет показатели длины, площади и степени покрытия сосудов с помощью цифрового анализа изображений для принятия обоснованных решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: Способствует согласованию с конечными точками регенеративной медицины и требованиями к доклинической интеграции тканей.
- Корпоративное использование: Создает масштабируемую и экономически эффективную платформу для анализа текущих разработок в области биоматериалов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность васкуляризации скаффолда и снижает механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: Стандартизирует оценку in vivo, повышает воспроизводимость и обеспечивает возможность масштабируемого скрининга.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и оптимизирует распределение ресурсов за счет количественной оценки ключевых биологических конечных точек.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов из биоматериалов для дальнейшей разработки с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области хирургии мелких животных и лечения ран.
- Необходим доступ к методу трансмиссионной визуализации и программному обеспечению для цифрового анализа (например, Vest egg tool).
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов хирургического вмешательства и визуализации для обеспечения воспроизводимости.
- Метод может быть адаптирован для различных типов скаффолдов и, возможно, для других систем органов при модификации протокола.
- Ограничения включают необходимость тщательной минимизации артефактов и коррекции областей интереса в процессе анализа.
