Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии
26 мая 2014 г.
Взаимодействия между белками являются основополагающими для всех клеточных процессов. Использование биолюминесценции резонансный перенос энергии, взаимодействие между парой белков можно контролировать в живых клетках и в реальном времени. Кроме того, эффекты потенциально патогенных мутаций могут быть оценены.
Общая цель данного эксперимента — наблюдение за взаимодействием между двумя белками и живыми культивируемыми клетками. Это достигается путем субклонирования CDNA для двух представляющих интерес белков в плазмиды, содержащие покрывающую последовательность люциферазы или желтого флуоресцентного белка, сокращенно YFP, для создания векторов для экспрессии белка в клетках млекопитающих. На втором этапе плазмиды трансфицируются в культивируемые клетки, что приводит к экспрессии белков слияния YFP и люциферазы.
Затем в клетки добавляется субстрат люциферазы для того, чтобы инициировать излучение света от люциферазы. Получены результаты, которые показывают взаимодействие между двумя гибридными белками на основе переноса энергии от люциферазы к YFP. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как осаждение Коуна, заключается в том, что он позволяет наблюдать взаимодействия белковых белков в живых клетках.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функциональной геномики, определив, влияет ли мутация, обнаруженная у пациента, на белковые взаимодействия. Демонстрацией первого этапа процедуры будет RAB tric, аспирант из моей лаборатории, чтобы начать создание плазмид, как описано в текстовом протоколе. Оцените их концентрацию на основе поглощения на уровне 260 нанометров.
Определите молекулярную массу каждой плазмиды, умножив количество пар оснований на 650 дальтон. Используйте концентрацию и молекулярную массу для расчета молярной концентрации каждого препарата плазмиды. Препараты плазмидной ДНК разбавляют до концентрации 36 наномоляров.
Это будут рабочие материалы, которые будут использоваться для приготовления смесей ДНК. Для переработки. Чтобы обеспечить успех, мы создаем электронные таблицы для предварительного расчета правильного количества каждого компонента, и мы уделяем большое внимание этому.
При настройке DN смесей. Приготовьте первую контрольную смесь ДНК, содержащую 1800 нанограмм филлерной плазмиды в итоговом объеме 20 микролитров воды. Затем настройте вторую контролируемую смесь ДНК, приготовив пять микролитров контрольной конструкции P look.
Добавьте плазмиду-филлер, чтобы довести общую массу ДНК до 1800 нанограммов. Добавьте воды, чтобы довести итоговый объем до 20 микролитров. Приготовьте третью контрольную смесь ДНК, содержащую пять микролитров контрольной конструкции P look и пять микролитров контрольной конструкции PYFP.
Добавьте наполнитель, плазмиду и воду, как и раньше. Наконец, создайте четвертую контрольную смесь ДНК, содержащую пять микролитров положительной контрольной конструкции. Снова добавляем наполнитель, плазмиду и воду таким же образом.
Затем приготовьте 3D смеси NA для тестирования на гомодимеризацию интересующего белка x. Для каждой смеси ДНК соедините пять микролитров соответствующей конструкции P look и пять микролитров конструкции PYFP, добавив плазмиду и воду. Затем приготовьте смеси ДНК для проверки взаимодействия между парой представляющих интерес белков X и Y. Для каждой смеси ДНК соедините пять микролитров соответствующей конструкции P look и пять микролитров конструкции PYFP вместе с плазмидой-наполнителем и соберите воду субфлюентным hec 2 9 3 клетки из колбы площадью 75 квадратных сантиметров разбавьте 10% от общего числа клеток в 13 миллилитрах питательной среды.
Затем дозируйте 130 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры тканей с белым прозрачным дном перед культивированием клеток в течение 24 часов. Затем рассчитайте количество лунок, которые необходимо трансфицировать, умножив количество смесей ДНК на три. Приготовьте мастер-смесь, содержащую 6,3 микролитра среды комнатной температуры, не содержащую сыворотки, и 0,18 микролитра реагента для трансфекции на лунку, перемешанную вортексированием, перед инкубацией при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем дозируется 20 мкл сыворотки свободной среды трансфективной реагентной смеси мастер-смеси в необходимое количество пробирок. Добавьте в каждую пробирку по два микролитра соответствующей смеси ДНК, выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут. Наконец, проведите трансфекцию в три лунки с каждой трансфекционной смесью.
Дозирование 6,5 микролитров трансфекционной смеси на лунку перед культивированием клеток в течение 36-48 часов. Для измерения сигнала BRET. Сначала растворите субстрат люциферазы живых клеток в концентрации 34 миллиграмма на миллилитр в ДМСО путем вортексирования.
Разведите восстановленный субстрат люциферазы живых клеток в соотношении от одного до 1000 градусов в среде для разбавления субстрата при температуре 37 градусов Цельсия. Дайте 50 микролитров среды для разбавления субстрата на лунку для перемешивания вихря. Осадок может образоваться, но не будет мешать анализу.
Аспирируйте питательную среду из 96-луночного планшета, диспонируйте 50 микролитров разведенного субстрата люциферазы живых клеток в каждую лунку после культивирования клеток в течение не менее двух часов. Снимите крышку с 96-луночной пластины и инкубируйте пластину в течение 10 минут при комнатной температуре внутри люминометра. Измеряйте излучение ЛЮЦИФЕРАЗЫ и YFP по одной скважине в соответствии с деталями в текстовом протоколе, интегрируйте сигналы излучения в течение 10 секунд.
Члены семейства транскрипционных репрессоров Fox P играют роль в развитии мозга. Мутации связаны с расстройствами речи и аутистического спектра. Известно, что FOX P two образует гомодимеры для валидации анализа Бретта на обнаружение Fox.
Клетки P two Homodimers трансфицировали конструкциями для экспрессии люциферазы в качестве донора или YFP в качестве акцептора, слитого либо с Fox P two, либо с сигналом ядерной локализации. Белки ЛЮЦИФЕРАЗЫ и YFP, нацеленные на ядерные цели, служат в качестве отрицательного контроля в качестве положительного контроля для обнаружения Бретта. Сигнальные клетки также трансфицировали конструкцией для экспрессии гибридного белка люциферазы YFP.
Увеличение сигнала BRET показывает, что анализ Брета эффективен при обнаружении изображений флуоресцентной микроскопии Fox P двух клеток, трансфицированных YFP, слитым с сигналом ядерной локализации, или с YFP, слитым с FOX P два. Специфичность взаимодействия была продемонстрирована путем введения мутации в FOX P two, которая, как известно, нарушает димеризацию. При совместном слиянии люциферазы Fox P двух дельта E 400 и YFP Fox B двух гибридных белков.
Наблюдалось снижение сигнала дыхания по сравнению с тем, когда Fox B two и YFP Fox B two были соэкспрессированы. Это снижение сигнала не было связано с изменением субклеточной локализации мутантного белка для оценки эффективности анализа Брета в выявлении типичных взаимодействий, было протестировано взаимодействие Fox P two с Fox P one, сигнал Бретта наблюдался в обеих возможных конфигурациях анализа. Кроме того, пригодность анализа Бретта или детектирования взаимодействия Fox P two с белками, не относящимися к FOX P, была проверена путем изучения взаимодействия с CT BP one, транскрипционным со-репрессором и известным партнером по взаимодействию Fox P two.
Взаимодействие Fox P two CT BP one было обнаружено с помощью анализа Бретта, когда Fox P two был донорским гибридным белком, а CT P one был акцептором, но не в обратной конфигурации. Взаимодействие между FOX P 2 и CT P 1 наблюдалось, несмотря на то, что лишь незначительная часть CT BP 1 была локализована в ядре, что подчеркивает чувствительность данного анализа. Наконец, анализ Брета был использован для изучения влияния патогенных мутаций в Fox P two на белковые взаимодействия.
Сообщалось, что две точечные мутации у Fox P two вызывают редкое аутосомно-доминантное расстройство, влияющее на речь и язык. Способность мутантных белков к димеризации с диким типом P two была оценена с помощью анализа BRET. Мутация R 3 28 X, но не мутация R 5 53 H, нарушает результаты димеризации с использованием дикого типа Fox B two в качестве донора и мутантного Fox B two.
Как показано на примере акцептора, те же результаты наблюдались и при обратной конфигурации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как применять анализ хлеба для мониторинга белковых взаимодействий. Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
После этой процедуры могут быть применены дополнительные методы для анализа активности интересующего вас белка с целью оценки функциональных последствий наблюдаемого взаимодействия белкового белка.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено наблюдению за взаимодействием двух белков в живых культурах клеток с помощью биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET). Этот метод позволяет проводить мониторинг белковых взаимодействий в режиме реального времени и оценивать влияние патогенных мутаций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Белковые взаимодействия
- Визуализация живых клеток
Теоретическая часть
- Белковые взаимодействия имеют решающее значение для клеточных процессов.
- Традиционные методы изучения этих взаимодействий имеют свои ограничения.
- BRET представляет собой новый подход к наблюдению за взаимодействиями в режиме реального времени.
- Этот метод также может помочь оценить влияние мутаций на функцию белков.
Цель исследования
- Для наблюдения за взаимодействием двух специфических белков.
- Для использования BRET для мониторинга в режиме реального времени в живых клетках.
- Для оценки влияния потенциально патогенных мутаций на эти взаимодействия.
Используемые методы
- Субклонирование кДНК белков в плазмиды.
- Трансфекция плазмид в культивируемые клетки млекопитающих.
- Экспрессия слитых белков YFP и люциферазы.
- Добавление субстрата люциферазы для инициации излучения света.
Основные результаты
- Успешная экспрессия слитых белков YFP и люциферазы в живых клетках.
- Наблюдение переноса энергии, указывающее на белок-белковые взаимодействия.
- Демонстрация преимуществ BRET перед традиционными методами.
- Изучение влияния мутаций на взаимодействия белков.
Выводы
- BRET является эффективным методом изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
- Данный метод позволяет получить ценные сведения о динамике взаимодействий белков.
- Он имеет потенциал применения для понимания влияния мутаций на клеточные процессы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) позволяет осуществлять количественный мониторинг белок-белковых взаимодействий в живых клетках в режиме реального времени, обеспечивая чувствительный и физиологически релевантный анализ для валидации мишеней. Этот подход способствует раннему поиску, подтверждая слабые, транзиторные или зависящие от условий среды взаимодействия, которые могут быть упущены при использовании конечных анализов, что повышает прогностическую уверенность в терапевтических гипотезах. Обнаруживая нарушения взаимодействий, вызванные патогенными мутациями, BRET помогает снизить механистические риски и предоставляет данные для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки при доклиническом выборе мишени.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Подтверждает предполагаемые белок-белковые взаимодействия, выявленные методом двухгибридной системы дрожжей или масс-спектрометрии, в контексте живых клеток.
- Научная ценность: Позволяет обнаруживать слабые или транзиторные взаимодействия, чувствительные к естественной биохимической среде, что повышает достоверность определения мишеней.
- Практическая ценность: Требует минимальных временных затрат и небольшого количества реагентов, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ сетей взаимодействий.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные значения отношений BRET, которые отражают силу взаимодействия и близость молекул, что способствует стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Совместимость с форматом 96-луночных планшетов и показаниями люминометра упрощает масштабирование при скрининге соединений или мутантов.
- Практическая ценность: Позволяет проводить кинетическую оценку динамики взаимодействия во времени, обеспечивая возможность использования форматов скрининга с временным разрешением.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет оценить влияние мутаций, выявленных у пациентов, на белковые взаимодействия, связывая генетические данные с функциональными последствиями.
- Научная ценность: обеспечивает картирование доменов взаимодействия и оценку эффектов посттрансляционных модификаций, что способствует анализу зависимости структуры от функции.
- Практическая ценность: использование одной и той же системы живых клеток на этапах поиска и доклинических исследований обеспечивает трансляционную преемственность.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод BRET вписывается в общий процесс разработки лекарственных средств — от оценки связывания с мишенью до оптимизации соединений-лидеров, где данные о взаимодействиях позволяют определить приоритеты и провести дальнейшие механистические исследования.
- Биология открытий: проверка терапевтических гипотез путем подтверждения взаимодействия интересующих белков в живых клетках, что позволяет снизить количество ложноположительных результатов, характерных для искусственных систем.
- Скрининг: получение воспроизводимых количественных показателей, позволяющих сравнивать белки дикого типа и мутантные белки, а также оценивать влияние соединений на силу взаимодействия.
- Аналитика: излучение отчетливых сигналов донора и акцептора, которые могут быть подвергнуты рациометрическому анализу для нормализации вариабельности экспрессии, что повышает достоверность данных.
- Трансляционные исследования: оценка того, нарушают ли мутации, связанные с заболеванием, ключевые взаимодействия, что обеспечивает функциональную валидацию генетических мишеней.
- Корпоративное повторное использование: создание универсальной платформы для скрининга взаимодействий по нескольким мишеням, что снижает трудозатраты на повторную разработку анализа.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования за счет выявления взаимодействий в физиологически значимой среде живых клеток.
- Операционная ценность: стандартизирует измерение взаимодействий благодаря единообразному добавлению субстрата и интеграции с люминометром, что снижает вариативность между лунками.
- Стратегическая ценность: помогает принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки, подтверждая или опровергая гипотезы о взаимодействии до осуществления значительных инвестиций.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков, основываясь на стабильности взаимодействия и чувствительности к мутациям.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярного клонирования для создания химерных конструкций с люциферазой и YFP.
- Необходим доступ к люминометру для последовательного измерения эмиссии донора и акцептора.
- Требуется оптимизация соотношения экспрессии во избежание насыщения донора или акцептора, которое может привести к искажению сигналов BRET.
- Необходимы контроли неспецифического переноса энергии, включая не взаимодействующие пары химерных белков и мутанты с измененной субклеточной локализацией.
- Метод ограничен необходимостью близкого расположения (<10 nm) донора и акцептора, в связи с чем не все биологически значимые взаимодействия могут быть зафиксированы.
