Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении за взаимодействием двух белков в живых культивируемых клетках. Это достигается путем субклонирования кДНК двух интересующих белков в плазмиды, содержащие кодирующую последовательность люциферазы или желтого флуоресцентного белка (сокращенно YFP), для создания векторов экспрессии белков в клетках млекопитающих. На втором этапе плазмиды трансфецируют в культивируемые клетки, что приводит к экспрессии гибридных белков YFP и люциферазы.

Затем к клеткам добавляют субстрат люциферазы для инициирования испускания света люциферазой. Полученные результаты демонстрируют взаимодействие между двумя слитыми белками на основе переноса энергии от LUCIFERASE к YFP. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как ко-преципитация, является возможность наблюдения за белок-белковыми взаимодействиями в живых клетках.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функциональной геномики, позволяя определить, влияет ли обнаруженная у пациента мутация на белок-белковые взаимодействия. Первый этап процедуры продемонстрирует RAB tric, аспирант моей лаборатории. Для начала создайте плазмиды согласно текстовому протоколу. Определите их концентрацию на основе поглощения при 260 nanometers.

Определите молекулярную массу каждой плазмиды, умножив количество пар оснований на 650 Daltons. Используйте концентрацию и молекулярную массу для расчета молярной концентрации каждого препарата плазмиды. Доведите препараты плазмидной ДНК путем разведения до концентрации 36 nano molar.

Это будут рабочие стоки, которые будут использоваться для приготовления смесей ДНК для трансфекции. Самым сложным аспектом данной процедуры является приготовление смесей ДНК. Чтобы гарантировать успех, мы создаем электронные таблицы для предварительного расчета точного количества каждого компонента и проявляем при этом особую тщательность.

При подготовке смесей ДНК приготовьте первую контрольную смесь ДНК, содержащую 1800 nanograms плазмиды-наполнителя в конечном объеме 20 microliters воды. Затем подготовьте вторую контрольную смесь ДНК, используя пять microliters контрольной конструкции P look.

Добавьте филлерную плазмиду, чтобы довести общую массу ДНК до 1800 nanograms. Добавьте воду, чтобы довести конечный объем до 20 microliters. Приготовьте третью контрольную смесь ДНК, содержащую пять microliters контрольной конструкции P look и пять microliters контрольной конструкции PYFP.

Добавьте плазмиду-заполнитель и воду, как и раньше. Наконец, подготовьте четвертую контрольную смесь ДНК, содержащую five µL конструкции положительного контроля. Снова добавьте заполнитель, плазмиду и воду аналогичным образом.

Затем приготовьте смеси ДНК для проверки гомодимеризации исследуемого белка x. Для каждой смеси ДНК объедините пять µL соответствующей конструкции P look и пять µL конструкции PYFP, добавив плазмиду-заполнитель и воду. Затем приготовьте смеси ДНК для проверки взаимодействия между парой исследуемых белков X и Y. Для каждой смеси ДНК объедините пять µL соответствующей конструкции P look и пять µL конструкции PYFP вместе с плазмидой-заполнитель и водой. Соберите субконфлюэнтные клетки hec 2 9 3 из колбы объемом 75 см², разведите 10% от общего количества клеток в 13 мл культурной среды.

Затем внесите по 130 µL клеточной суспензии в каждую лунку белого 96-луночного планшета для культивирования тканей с прозрачным дном и культивируйте клетки в течение 24 часов. Далее определите количество лунок для трансфекции, умножив число смесей ДНК на три. Приготовьте мастер-микс, содержащий 6,3 µL бессывороточной среды комнатной температуры и 0,18 µL реагента для трансфекции на одну лунку; перемешайте смесь на вортексе и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем распределите по 20 µL мастер-микса реагента для трансфекции в бессывороточной среде в необходимое количество пробирок. Добавьте по 2 µL соответствующей смеси ДНК в каждую пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. В завершение проведите трансфекцию трех лунок каждой смесью для трансфекции.

Раздайте по 6,5 µL смеси для трансфекции в каждую лунку, после чего культивируйте клетки еще от 36 до 48 часов. Для измерения сигнала BRET сначала растворите субстрат люциферазы для живых клеток в DMSO в концентрации 34 mg/mL, используя вортекс.

Разведите реконструированный субстрат люциферазы для живых клеток в соотношении 1:1000 в среде для разведения субстрата, предварительно нагретой до 37 °C. Добавьте по 50 µL среды для разведения субстрата в каждую лунку и перемешайте на вортексе. Может образоваться осадок, который не повлияет на результаты анализа.

Отосೀರಿ культуральную среду из 96-луночного планшета и внесите по 50 µL разведенного субстрата люциферазы для живых клеток в каждую лунку после культивирования клеток в течение не менее двух часов. Снимите крышку с 96-луночного планшета и инкубируйте его в течение 10 минут при комнатной температуре внутри люминометра. Измерьте эмиссию LUCIFERASE и YFP поочередно для каждой лунки в соответствии с подробностями текстового протокола, интегрируя сигналы эмиссии в течение 10 секунд.

Белки семейства транскрипционных репрессоров FoxP играют важную роль в развитии головного мозга. Мутации в этих генах связаны с нарушениями речи и расстройствами аутистического спектра. Известно, что FOXP2 образует гомодимеры, что позволяет использовать анализ BRET для детекции Fox.

Клетки P two Homodimers трансфецировали конструктами для экспрессии люциферазы в качестве донора или YFP в качестве акцептора, слитых либо с Fox P two, либо с сигналом ядерной локализации. Белки LUCIFERASE и YFP, направляемые в ядро, служат отрицательным контролем, а для положительного контроля детектирования сигнала BRET клетки также трансфецировали конструктом для экспрессии слиткого белка люцифераза-YFP.

Увеличение сигнала BRET показывает, что анализ BRET эффективен для обнаружения гомодимеров Fox P two; здесь представлены изображения клеток, трансфецированных YFP, слитым с сигналом ядерной локализации, или YFP, слитым с FOX P two, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии. Специфичность взаимодействия была продемонстрирована путем введения мутации в FOX P two, которая, как известно, нарушает димеризацию. Это наблюдалось при коэкспрессии слитых белков люциферазы Fox P two delta E 400 и YFP Fox B two.

Наблюдалось снижение сигнала BRET по сравнению с совместной экспрессией Fox B2 и YFP Fox B2. Это снижение сигнала не было связано с изменением субклеточной локализации мутантного белка. Для оценки эффективности анализа BRET в обнаружении типичных взаимодействий было протестировано взаимодействие Fox P2 с Fox P1; сигнал BRET наблюдался в обеих возможных конфигурациях анализа. Кроме того, пригодность анализа BRET для обнаружения взаимодействия Fox P2 с белками, не относящимися к семейству FOX P, была проверена путем изучения взаимодействия с CTBP1 — транскрипционным корепрессором и известным партнером по взаимодействию Fox P2.

Взаимодействие Fox P two и CT BP one было обнаружено с помощью анализа BRET, когда Fox P two выступал в качестве донорного слитого белка, а CT BP one — в качестве акцептора, однако в обратной конфигурации взаимодействие не наблюдалось. Взаимодействие между FOX P two и CT BP one фиксировалось даже при том, что лишь незначительная часть CT BP one локализовалась в ядре, что подчеркивает чувствительность данного анализа. Наконец, метод BRET был использован для изучения влияния патогенных мутаций в Fox P two на белок-белковые взаимодействия.

Было сообщено, что две точечные мутации в гене Fox P two вызывают редкое аутосомно-доминантное заболевание, влияющее на речь и язык. Способность мутантных белков к димеризации с Fox P two дикого типа оценивали с помощью анализа BRET. Результаты использования Fox B two дикого типа в качестве донора и мутантного Fox B two показали, что мутация R 3 28 X, но не R 5 53 H, нарушает димеризацию.

Как показано для акцептора, аналогичные результаты наблюдались и для обратной конфигурации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как применять метод с использованием бусинок для мониторинга белок-белковых взаимодействий. Эта методика открыла исследователям в области клеточной биологии путь к изучению белок-белковых взаимодействий в живых клетках.

После выполнения данной процедуры можно применить дополнительные методы для анализа активности исследуемого белка с целью оценки функциональных последствий наблюдаемого белок-белкового взаимодействия.