Простой и быстрый протокол для измерения нейтральных липидов в клетках водорослей с помощью флуоресцентной

Общая цель данного эксперимента заключается в измерении содержания нейтральных липидов в клетках водорослей с помощью флуоресцентного красителя нильского красного цвета. Это достигается путем предварительного суспензирования клеток в растворе этанола для проницаемости клеточной стенки и клеточной мембраны. В качестве второго шага добавляется нильский красный флуоресцентный краситель, который проникает в клетки и накапливается в неполярных областях клетки, включая нейтральные липидные тела.

Затем образцы подвергаются воздействию возбуждающего источника света с яркостью 530 нанометров, в результате чего нильский красный цвет, поглощенный нейтральными липидными телами, флуоресцирует на частоте 604 нанометра. Результаты получают в массовом масштабе путем проведения отдельных испытаний в микролунке и использования спектрофотометра для получения быстрых показаний флуоресценции. Показания показывают линейную зависимость между содержанием нейтральных липидов в клетках lgal и интенсивностью измерения флуоресценции.

Преобразование измерений флуоресценции в содержание масла может быть достигнуто с помощью калибровочной кривой, подготовленной с использованием ячеек с известным составом масла. Основное преимущество этой методики перед существующими протоколами, такими как гравиметрический метод Bly dire, заключается в том, что она позволяет быстро определять содержание нейтральных липидов с использованием материалов, доступных в большинстве лабораторий. Этот метод обеспечивает немедленную обратную связь о производительности биопроцесса во время выращивания водорослей.

Кроме того, высокая пропускная способность, обеспечиваемая планшетным считывателем 96 Well, идеально подходит для скрининговых исследований и факторных экспериментов. Хотя этот метод был оптимизирован для chlorella и s Desus, он может быть легко модифицирован для анализа других видов lgal. Хорошо. Для начала удалите объем образца из растущей культуры водорослей, который обеспечит не менее 200 миллиграммов сухой биомассы.

Предпочтительно от 400 до 600 миллиграммов. Центрифугируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут 10 000 раз. G, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу с таким же объемом фосфатного буфера, который соответствует pH питательной среды.

Повторите этот процесс в общей сложности для трех этапов стирки. Повторно суспендируйте гранулу в деионизированной воде и переложите в предварительно взвешенную чашу для взвешивания. Дайте образцу высохнуть при температуре 50 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Высушенные культуры водорослей можно хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования. Измерьте примерно 50 миллиграммов биомассы сухих водорослей в чашке для сыворотки. Переложите биомассу в ступку, предварительно промытую гексаном, при необходимости промойте чашку с сывороткой небольшим количеством гексана с помощью бывшей пипетки, чтобы полностью перенести биомассу в ступку.

Далее измельчаем водорослевую биомассу в течение пяти минут с помощью пестика. Начните с легкого растирания и постепенно увеличивайте интенсивность. Измельчите биомассу в тонкую и однородную пасту.

В течение пятиминутного периода добавьте в ступку несколько миллилитров гексана и смешайте полученную кашицу с пестиком до ее гомогенизации. Следите за тем, чтобы все клеточные остатки, прилипшие к стенкам раствора, были выбиты и суспензированы в жидкости. Затем переложите массовую смесь гексановых ячеек в совместимую центрифужную пробирку.

Повторите от трех до пяти раз, пока вся биомасса не будет перенесена в центрифужную трубку. Центрифугируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут 10 000 раз. G. После центрифугирования осторожно нанесите надосадочную жидкость в предварительно взвешенную металлическую чашку, которую можно хранить в вытяжном шкафу.

Проведите вторую экстракцию гексаном, добавив три миллилитра гексана в гранулу и энергично переборщив. В течение одной минуты повторите центрифугирование и перенос надосадочной жидкости. Определяют массу извлеченного масла гравиметрическим методом после того, как гексан полностью испарится.

Для флюорометрического количественного определения подготовьте все образцы водорослей с той же концентрацией биомассы и тем же способом, что и стандарты, использованные при измерении. Для этого суспендируя предварительно высушенные образцы в соответствующем количестве фосфатного буфера. При необходимости используйте гомогенизатор для облегчения ресуспензии высушенных клеток водорослей.

Для каждого образца смешайте 80 микролитров приготовленного 30%-ного раствора этанола, 10 микролитров приготовленного раствора нильского красного и 10 микролитров суспензии водорослей в одной лунке 96-луночного планшета. Чтобы правильно учесть вариабельность измерения флуоресценции, выполните пять повторений каждого образца. Затем запустите двухточечную калибровочную кривую с заранее подготовленными стандартами.

Чтобы учесть ежедневные изменения в приборе и подготовиться к выполнению измерений флуоресценции в спектрофотометре с многолуночным планшетным считывателем, установите параметры на встряхивание со скоростью 1200 об/мин и вращение вокруг трех миллиметров в течение 30 секунд с последующей инкубацией при 40 градусах Цельсия в течение 10 минут. Еще одно встряхивание при 1,200 оборотах в минуту и вращение вокруг трех миллиметров в течение 30 секунд, а также запись флуоресценции с возбуждением на 530 нанометрах и излучением на 604 нанометрах. Затем начните забег в качестве последнего шага.

Преобразуйте результаты измерений флуоресценции в содержание масла, используя результаты внутренних стандартов для выполнения флуоресцентной микроскопии. Используйте образец, приготовленный с нильским красным красителем, для подготовки предметного стекла технологического образца в соответствии со стандартными лабораторными процедурами. Начав с микроскопа в режиме пропускания, загрузите подготовленное предметное стекло в микроскоп и расположите ячейки с желаемым увеличением.

После фокусировки переключите микроскоп из режима пропускания в режим эпифлуоресцентного освещения. Теперь источник света должен исходить непосредственно от линзы объектива, что можно подтвердить визуально, наблюдая за пространством между предметным стеклом и линзой объектива. Вставьте зеленый фильтр возбуждения в источник света и красный фильтр излучения в траекторию наблюдения за светом.

Флуоресценция окрашенных клеток теперь должна быть непосредственно видна через окуляр. Переключите режим наблюдения микроскопа с окуляра на установленную камеру и используйте программное обеспечение для просмотра для получения изображения флуоресцентных клеток. Конкретные настройки зависят от приборов, оборудования и типов ячеек.

Репрезентативные клетки водорослей, окрашенные красителем Нила, показаны изображения протона, выращенного в избытке азота, что приводит к очень низкому внутриклеточному накоплению липидов, которые показаны в отличие от образцов OID, выращенных с ограничением азота. При просвечивающем освещении липидные тела клеток могут быть визуализированы при тщательном осмотре, где они выглядят как блестящие круглые структуры и составляют большую часть объема клетки. Показанные здесь клетки содержат только 5% масла по сухому весу и не содержат значительных уровней липидных тел при соответствующих условиях освещения.

Различия в этих образцах преувеличены. Нежирные клетки выглядят как флуоресцентные кольца с темными телами, в то время как богатые маслом клетки демонстрируют яркое оранжево-красное свечение там, где они накопили липидные тела. Нильский красный будет флуоресцировать на разных длинах волн в зависимости от наличия нейтральных липидов, фосфолипидов, расположенных на клеточной стенке, и неполярных клеточных белков, поэтому нежирные клетки выглядят как флуоресцентные кольца с темными телами.

Эта неспецифичность также является причиной фонового уровня флуоресценции во время измерений нейтральных липидов с помощью спектрофотометра В оптимизированных условиях анализа легко достижимы калибровочные кривые со значениями R квадрата более 0,980. Связь между содержанием масла в клетках и флуоресценцией становится нелинейной, если клетки окрашены в раствор, в котором отсутствует растворитель-носитель, такой как этанол. Представленные здесь данные имеют R-квадрат 0,395 и были получены путем проведения протокола в 0%-ном растворе этанола.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 15-20 минут при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры крайне важно убедиться, что все образцы подготовлены при одинаковой концентрации биомассы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить нейтральное содержание липидов в клетках lgal с использованием как традиционных протоколов экстракции гексана, так и более простой процедуры окрашивания NAL красным флуоресцентным цветом.