Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

Общая цель данной процедуры заключается в выделении высококачественной РНК из образцов сыворотки. Для этого используется оптимизированный нами вариант распространенного протокола MRC try reagent RTLS. Процесс начинается с разведения сыворотки в соотношении 1:5 водой, не содержащей нуклеаз, для снижения загрязнения белками.

Второй этап заключается в использовании пробирок Phase Lock объемом два миллилитра для первого шага центрифугирования. Это позволяет удержать основную часть загрязнений, таких как фенол и белки, в органической фазе. Далее следует третий и заключительный этап оптимизации — кратковременное центрифугирование при 12 000 g, которое удаляет остаточные загрязнения из осадка РНК перед промывкой этанолом.

Заключительным этапом является объединение двух модифицированных препаратов РНК, полученных от одного и того же пациента, если требуется более высокий общий выход РНК. В конечном счете, используя данный модифицированный метод, который включает растворение сыворотки в воде, свободной от нуклеаз, применение пробирки Phase Lock для улавливания основных загрязняющих веществ и кратковременное центрифугирование, мы демонстрируем возможность максимизации выхода малых некодирующих РНК при выделении РНК из сыворотки.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как стандартный протокол выделения РНК с использованием триола, является возможность максимизировать выход РНК из сыворотки за счет простых модификаций. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями, поскольку малые РНК содержатся в сыворотке в низких концентрациях. Оптимизированный метод и визуализация этих этапов позволят улучшить извлечение данных РНК и помогут начинающим успешно выполнить процедуру выделения.

Для начала разморозьте предварительно подготовленный замороженный образец сыворотки на льду, затем перенесите 400 µL свежеразмороженной сыворотки в промаркированную микроцентрифужную пробирку. Затем разбавьте сыворотку 100 µL воды, свободной от РНКаз, и добавьте 50 µL протеиназы K в концентрации 1 mg/mL. После этого инкубируйте разбавленную сыворотку при 37 °C в течение 20 минут для обеспечения адекватного переваривания белков, чтобы гарантировать полную солюбилизацию при добавлении 1.5 mL реагента Trizol RTLS и 100 µL Formamide.

Кратковременно переверните пробирку с гомогенатом и проведите повторное пипетирование в течение пяти секунд. Затем перенесите смесь в маркированную пробирку Heavy Phase Lock объемом two milliliter. Центрифугируйте гомогенат при 12, 000 GS в течение 20 минут при температуре four degrees Celsius.

Затем осторожно перенесите один миллилитр полученного водного раствора в новую пробирку с низким связыванием ДНК. Органическая фаза и интерфаза должны остаться под белым гелем пробирки для разделения фаз. Затем добавьте пять микролитров гликогена и 500 микролитров 100% изопропанола к водному раствору.

Перемешайте раствор путем инверсии и инкубируйте его в течение ночи при температуре -20 °C. После ночной инкубации центрифугируйте образец в течение 20 минут при 12 000 g в центрифуге при температуре 4 °C. Затем удалите прозрачный супернатант и выполните кратковременное центрифугирование в течение двух минут при 16 000 g в центрифуге при температуре 4 °C.

С помощью пипетки аккуратно удалите прозрачный раствор вокруг осадка. Затем промойте осадок одним миллилитром 70% ethanol и центрифугируйте образец при 10, 000 GS в течение 10 минут. Чтобы визуализировать осадок, наклоните пробирку на темном фоне и слейте промывочный раствор.

Повторите промывку. Следующий этап. Ресуспендируйте осадок в 10 µL воды, свободной от РНК.

Убедитесь, что осадок полностью растворился, нагрев образец при 55 °C в течение пяти минут. В течение этого времени перемешивайте образец путем многократного пипетирования для получения пула с более высоким общим выходом РНК, используя два препарата РНК от одного и того же пациента. Определите количество ресуспендированной РНК с помощью УФ-спектрофотометра.

Спектрофотометр и оцените качество РНК с помощью биоанализатора 2100. Затем храните объединенные образцы РНК при температуре минус 80 °C для последующего использования. Спектрофотометрические профили РНК, выделенной из сыворотки крови человека, демонстрируют повышенный выход РНК благодаря добавлению нескольких этапов к традиционному методу Чомчинского.

Типичный УФ-профиль РНК, выделенной из сыворотки крови человека, контрастирует с профилями при использовании этапов оптимизации, включая добавление гликогена и дополнильное центрифугирование; применение каждого из этих инструментов в совокупности привело к снижению количества загрязнений и увеличению общего выхода РНК. Чистота образца РНК была дополнительно повышена за счет использования фазового блокирующего геля, который улавливает фенол и белки. Кроме того, увеличение объема сыворотки оказывает заметное влияние на выход РНК.

Для дальнейшего анализа качества образца был получен профиль биоанализатора. Одиночный пик примерно на уровне 21 нуклеотида соответствует фракции микроРНК. В соответствии с протоколом были проведены профилирование на микрочипах и ПЦР в реальном времени. Профиль этого массива для трех образцов рака головы и шеи и одного нормального образца S демонстрирует экспрессию микроРНК; данные были проанализированы с помощью иерархической кластеризации и представлены в виде тепловой карты, на которой видна повышающая и понижающая регуляция микроРНК.

Для специфических микроРНК были построены следующие кривые амплификации QPCR. Эти данные затем использовались для построения значений сырого CT для нормальной сыворотки. После освоения данный метод может быть применен для любого количества пациентов с получением высококачественной РНК при условии правильного соблюдения процедуры. Для решения дополнительных задач, таких как поиск и валидация биомаркеров, могут быть использованы другие методы, например количественная ПЦР или секвенирование следующего поколения.