Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

Общая цель этой процедуры заключается в выделении высококачественной РНК из образцов сыворотки. Используя нашу оптимизированную версию распространенного MRC, попробуйте реагент RTLS по протоколу RTLS. Это достигается путем предварительного разбавления сыворотки в соотношении один к пяти водой, свободной от нуклеаз, для снижения белкового загрязнения.

Второй шаг заключается во введении двух миллилитровых пробирок с фазовой блокировкой для первого этапа центрифугирования. Это удерживает большинство загрязняющих веществ, таких как фенол и белки, в органической фазе. Далее, третьим и последним шагом оптимизации является мгновенная центрифугация при 12 000 сыров, которая удаляет любые остаточные загрязнения из гранул РНК перед промывкой этанолом.

Последним шагом является объединение двух модифицированных препаратов РНК от одного и того же пациента, если требуется более высокий общий выход РНК. В конечном счете, используя этот модифицированный метод, который Solubilize сыворотка в воде, не содержащей нуклеаз, использует трубку с фазовой блокировкой для улавливания основных загрязнителей и вводит мгновенный спин. Мы показываем, что возможно максимальное восстановление малых РНК, не покрывающих кожу, из выделения РНК из сыворотки.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как стандартный протокол выделения триольной РНК, заключается в том, что с помощью простых модификаций мы можем максимизировать выход РНК из сыворотки. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что небольшие РНК обнаруживаются в небольших количествах в сыворотке. Оптимизированный метод и визуализация этих этапов улучшат восстановление этих РНК и приведут новичков к успешному выделению наконечника.

Для начала разморозьте заранее подготовленный замороженный образец сыворотки на льду, затем переложите 400 микролитров только что размороженной сыворотки в пробирку с маркировкой микроцентрифуги. Далее разведите сыворотку со 100 микролитрами воды, свободной от Rназы и добавьте 50 микролитров протеиназы К в концентрации один миллиграмм на миллилитр. Затем инкубируйте разведенную сыворотку при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы обеспечить адекватное переваривание белка и обеспечить полную солюбилизацию при 1,5 миллилитрах три-реагента RTLS и 100 микролитрах четырех промо-анолов.

Кратковременно инвертируйте гомогенат и выполняйте повторяющееся пипетирование в течение пяти секунд. Затем переложите смесь в пробирку с маркировкой на два миллилитра с тяжелым фазовым блокировкой. Вращайте гомогенат при температуре 12 000 GS в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Далее осторожно сцедите один миллилитр полученного водного раствора в свежую ДНК с низким связыванием пробирку. Органический материал и граница раздела должны быть заключены под белым гелем трубки фазовой блокировки. Затем добавьте в водный раствор пять микролитров гликогена и 500 микролитров 100% изопропанола.

Смешайте раствор методом инверсии и выдержите его в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия. После ночной инкубации образец центрифугируется в течение 20 минут при 12 000 GS в центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия. Затем выбросьте прозрачную надосадочную жидкость и выполните вспышку в течение двух минут при 16 000 GS в центрифуге с температурой четыре градуса Цельсия.

С помощью пипетки осторожно удалите прозрачный раствор вокруг гранулы. Затем промойте гранулу одним миллилитром 70% этанола и центрифугируйте образец при 10 000 GS в течение 10 минут. Чтобы визуализировать гранулы, наклоните трубку перед темным фоном и удалите моющий раствор.

Повторите стирку. Повышать. Суспензируем гранулу в 10 микролитрах воды, свободной от РНК.

Убедитесь, что гранула полностью растворилась, нагрев образец до 55 градусов Цельсия в течение пяти минут. В течение этого времени смешайте образец с повторным пипетированием для получения более высокого пула общего выхода РНК, два препарата РНК от одного и того же пациента. Количественно оцените ресуспендированную РНК с помощью УФ-спектрофотометра

и оцените качество РНК с помощью биоанализатора 2100. Затем храните объединенные образцы РНК при температуре минус 80 градусов Цельсия для использования в последующих приложениях. Спектральные фотометрические профили РНК из сыворотки крови человека демонстрируют улучшенный выход РНК за счет добавления нескольких этапов к традиционному подходу Хомского.

Типичный УФ-профиль РНК, выделенной из сыворотки крови человека, контрастирует с теми, в которых используются этапы оптимизации, включая добавление гликогена и дополнительного спина, и каждый из этих инструментов в сочетании приводит к снижению контаминантов и увеличению общего выхода РНК. Чистота образца РНК была дополнительно увеличена за счет использования геля с фазовой блокировкой, который захватывает фенол и белки. Кроме того, увеличение объема сыворотки оказывает заметное влияние на выход РНК.

Для дальнейшего анализа качества образца была проведена трассировка с помощью биоанализатора. Один спайк примерно на 21 нуклеотиде представляет собой профилирование матрицы с фракцией микроРНК, и QPCR была выполнена после процедуры. Этот профиль массива из трех видов рака головы и шеи и одного нормального S показывает экспрессию микроРНК, анализируется с использованием иерархической кластеризации и представлен в виде тепловой карты, на которой можно увидеть повышение и подавление микроРНК.

Для конкретных микроРНК были построены следующие кривые амплификации QPCR. Эти данные затем были использованы для построения графика исходных значений КТ для нормальной сыворотки После освоения этот метод может быть выполнен на любом количестве пациентов, производящих высококачественную РНК в сегодняшнем максимуме, если он выполнен правильно после процедуры. Другие методы, такие как количественная ПЦР или секвенирование нового поколения, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как обнаружение и валидация биомаркеров.