Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за динамическим взаимодействием одного ДНК-связывающего белка с молекулой ДНК. Это достигается путем объединения в специально сконструированном микроскопе двух методов анализа единичных молекул: двойного оптического пинцета и флуоресцентной микроскопии. Данная установка также оснащена освещением в светлом поле для визуализации и системой нанометровой стабилизации образца.

На втором этапе создается многоканальная проточная ячейка, интегрированная в микрофлюидную систему, которая позволяет направлять до четырех ламинарных потоков для эффективного захвата и сборки всех компонентов, необходимых для эксперимента. Далее, для проведения экспериментов, собирается конструкция из единичной молекулы. Сначала в первом канале с помощью двойного оптического пинцета захватываются две микросферы, покрытые полосками титина.

Затем две захваченные бусины перемещают во второй канал для прикрепления матрицы ДНК, меченной биотином с обоих концов. Наличие одной молекулы ДНК проверяют в третьем канале с помощью анализа принудительного растяжения ДНК. В завершение конструкцию «бусина-ДНК-бусина», называемую ДНК-гантелью, перемещают в белковый канал, содержащий флуоресцентно меченный белок-репрессор лактозы.

Получены результаты, демонстрирующие диффузию и специфическое связывание одиночных молекул белка LAC eye с одной растянутой молекулой ДНК, а также количественное определение кинетических параметров движения LAC eye. Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими методами анализа одиночных молекул являются возможность контролировать натяжение, прикладываемое к молекуле, возможность точно отслеживать перемещения связывающих белков над стабильным нанометровым участком, а также способность работать на значительном удалении от поверхности покровного стекла. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы о взаимодействии белков с ДНК, особенно в отношении механики регуляции экспрессии генов, а также динамики диффузии белков вдоль ДНК в механизмах поиска мишени.

Данная демонстрация метода очень полезна для показа практических аспектов конструирования проточной ячейки, манипулирования образцами и сборки конструкции с ДНК-бусиной. В этом видео сначала будет продемонстрировано, как проверить стабильность наведения двух ловушечных лазеров, используя в качестве эталона микробусины, закрепленные на поверхности покровного стекла. Подробную информацию о проектировании и устройстве установки оптического пинцета можно найти в сопровождающем тексте протокола.

Используйте покровное стекло размером 24 × 60 мм, чтобы распределить 2 µL силикатных бусин по поверхности покровного стекла размером 24 × 32 мм. С помощью двух кусочков двустороннего скотча закрепите покровное стекло размером 24 × 32 мм на предметном стекле микроскопа для создания проточной кюветы.

Заполните проточную кювету 50 мМ фосфатным буфером и герметизируйте ее силиконовой смазкой. Один кварцевый шарик при светлопольной микроскопии с увеличением приблизительно 2000 крат. Поле зрения должно составлять примерно 7x5 мкм при разрешении 68x576 пикселей, чтобы диаметр изображения шарика составлял приблизительно 190 пикселей. Компенсируйте тепловой дрифт с помощью программного обеспечения с обратной связью, которое вычисляет положение по осям XY по центру изображения и по оси Z по дифракционным кольцам, и корректирует дрифт.

Перемещая пьезостадией с нанометровой точностью или выше, совместите центр левой ловушки с центром микросферы и измерьте шум положения и его стандартное отклонение с помощью квадрантного фотодетектора (QDP). Повторите измерение для правой ловушки. Стандартное отклонение шума положения должно составлять несколько нанометров, чтобы обеспечить точную локализацию ДНК-связывающих белков при изготовлении проточной кюветы.

Сначала с помощью алмазного сверла в предметном стекле размером 76 × 76 × 1 мм просверливают отверстия диаметром 1 мм, чтобы создать четыре входа и один выход. Это позволит организовать до четырех параллельных потоков буфера.

Каждый из них содержит один из различных компонентов, необходимых для эксперимента: микросферы, флуоресцентно меченную ДНК, белок и буфер для визуализации. Очистите предметное стекло этанолом и отцентрируйте порт с установленным уплотнительным кольцом и адгезивным кольцом на стекле вокруг отверстий для доступа. На этом этапе крайне важно использовать перчатки, чтобы избежать появления отпечатков пальцев, которые могут помешать процессу склеивания.

С помощью второго зажима закрепите нанопорты на предметном стекле и поместите его в предварительно разогретую до 180 °C печь на один час для обеспечения полной фиксации. Тем временем нарисуйте на листе бумаги контур проточной ячейки. Ширина канала должна составлять примерно 3 мм и соответствовать расположению отверстий на предметном стекле.

Поместите чертеж поверх двух фрагментов профиля и с помощью скальпеля сделайте резкие и непрерывные разрезы по нарисованному контуру. Удалите все образовавшиеся выступы и выбросьте нижний слой парфюма, который использовался только для обеспечения чистоты основы. Затем переверните предметное стекло с закрепленными на нем нанопортами и поместите его в металлический держатель.

Аккуратно совместите контур камеры из парафильма с отверстиями, следя за тем, чтобы парафильм не перекрывал входные и выходные отверстия крышки камеры с очищенным покровным стеклом микроскопа, и осторожно удалите излишки парафильма вокруг камеры. Поместите два предварительно нагретых до 120 °C термоблока поверх проточной ячейки, чтобы обеспечить равномерное давление на нее. Оставьте парафильм плавиться примерно на 25 минут.

Следующим шагом является подготовка резервуара под давлением и контейнеров с буфером. Резервуар под давлением изготовлен из плексигласа и позволяет разместить до шести контейнеров с буфером. Сначала подсоедините запорные клапаны на выходе из контейнеров с буфером; для включения потока буфера рычаг клапана должен находиться в вертикальном положении, для выключения — быть повернутым по часовой стрелке.

В ходе экспериментов установите проточную кювету на предметный столик микроскопа. Затем соедините запорные клапаны с помощью трубок из полиэфирэфиркетона (PEEK), а безфланцевые фитинги — с входными отверстиями проточной камеры. Трубки PEEK имеют внутренний диаметр около 150 мкм; в качестве соединительного элемента между трубками PEEK и узлами нанопортов проточной кюветы используются отрезки трубок из фторированного этилен-пропилена длиной около 3 см с внутренним диаметром около 500 мкм.

Это необходимо для снижения потока буфера на входе в камеру, чтобы избежать повреждения проточной кюветы или отрыва нанопорта от стекла. С другой стороны, использование только трубок с большим внутренним диаметром потребовало бы больших объемов биологических образцов. Подключите выход проточной камеры к открытой пробирке Falcon, находящейся под атмосферным давлением.

Эта пробирка служит для сбора буфера, вытекающего из проточной камеры. Чтобы начать процедуру, добавьте по 1 мл буфера А в каждый контейнер с буфером и подайте давление 200 mbar для промывки соединительных трубок и проточной ячейки. Для этого можно использовать систему контроля давления.

Наконец, отрегулируйте давление воздуха внутри резервуара под давлением. Проверьте наличие пузырьков воздуха, которые могут нарушить плавность потока. Легкое постукивание по выпускной трубке поможет удалить оставшиеся пузырьки; снизьте давление до 20 millibars и убедитесь, что все каналы и трубки очищены от пузырьков воздуха, а буфер течет с одинаковой скоростью во всех каналах.

Доведите образцы до конечного объема 300 microliters. В данном эксперименте используются полистирольные бусины с покрытием из стрептавидина, линейная ДНК, биотинилированная с обоих концов и содержащая специфические мишени для связывания с белком-репрессором лактозы, а также флуоресцентно меченный белок-репрессор лактозы. Добавьте каждый образец в соответствующий контейнер шприца в следующем порядке: бусины в первый канал, ДНК — во второй, буфер для визуализации — в третий и меченный белок — в четвертый канал.

Включите поток при давлении 20 millibars и откройте отсечные клапаны, чтобы образцы поступили в проточный канал. Это легко определить по появлению частиц в канале с микросферами. При визуализации первого канала в режиме светлого поля включите два оптических пинцета и захватите по одной полистирольной микросфере в каждой ловушке.

Быстро перейдите ко второму каналу, чтобы другие микросферы не попали в ловушки. Обратите внимание, что прибытие в ДНК-канал легко определить по прекращению потока микросфер. Используя один акустооптический (AO) отклонитель или перемещение OD, перемещайте одну захваченную микросферу вперед и назад в непосредственной близости от другой микросферы, чтобы обеспечить прикрепление вытянутой потоком ДНК между двумя оптически захваченными микросферами.

При формировании ДНК-гантели статическая бусина начинает повторять движения бусины, которую ловушка активно перемещает вперед и назад. Быстро переведите систему в канал с буфером и выключите поток буфера. Выполните анализ кривой зависимости силы от растяжения, чтобы подтвердить наличие одной молекулы ДНК.

Это достигается путем разведения двух бусин в стороны с одновременным измерением натяжения ДНК. После получения одной ДНК-гантели снова включите поток и переместите гантель в белковый канал. Переключитесь на широкопольную флуоресцентную микроскопию для мониторинга взаимодействия меченого белка-репрессора лактозы с ДНК, выключите поток и начните регистрацию данных.

Данный метод позволяет обнаруживать отдельные молекулы репрессора лактозы или lacI, взаимодействующие с растянутой молекулой ДНК. На этой репрезентативной диаграмме одна молекула lacI диффундирует вдоль неспецифических последовательностей ДНК, в то время как другая молекула lacI специфически связана с одним оператором, расположенным в центре молекулы ДНК. На этом графике показано положение двух молекул lacI вдоль направления, соединяющего центры двух ловушек.

Положения молекул в зависимости от времени определялись с помощью алгоритма центра радиальной симметрии; на данном графике показано среднеквадратичное смещение (MSD) в зависимости от времени для одной молекулы LacI, диффундирующей вдоль растянутой молекулы ДНК. Коэффициент диффузии белка можно легко получить с помощью линейной регрессии данных. Сочетание методов манипуляции и визуализации представляет собой мощный подход, позволяющий осуществлять механический контроль над одним биологическим полимером, таким как ДНК, РНК или нить цитоскелета, и одновременно локализовать отдельные молекулы белков, взаимодействующих с самим полимером.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что сочетание методов манипулирования отдельными молекулами и методов визуализации требует тщательной разработки экспериментальной установки для обеспечения нанометровой стабильности подвешенного полимера. С другой стороны, необходима правильная конструкция биологического зонда, чтобы гарантировать пространственное разделение между ловушкой G-лазера и флуоресцентным зондом. Подробности см. в сопроводительном тексте протокола.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как собрать молекулу ДНК между двумя оптическими ловушками. Сборка данной конструкции эффективнее всего осуществляется с использованием многоканальной проточной ячейки, подробное описание которой мы предоставили. Мы также указали, как оптимизировать поток буфера и удалить пузырьки воздуха, которые в противном случае могли бы поставить под угрозу ваши эксперименты.

В комбинированном текстовом протоколе приведены инструкции по маркировке ДНК с помощью bioTE, что необходимо для сборки с бисеринами, покрытыми стрептавидином, а также протоколы маркировки белка. В завершение мы пошагово продемонстрировали операции по количественному определению связывания и диффузии одиночного белка-репрессора лактозы на растянутой молекуле ДНК.