Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за динамическим взаимодействием между одним ДНК-связывающим белком и молекулой ДНК. Это достигается за счет объединения в специально созданном микроскопе двух одномолекулярных методов, двойного оптического пинцета и флуоресцентной микроскопии. Эта установка также оснащена подсветкой яркого поля для визуализации и нанометровой стабилизации образца.

В качестве второго шага создается многоканальная проточная ячейка, интегрированная в микропроточную систему, которая позволяет четырем ламинарным потокам эффективно набирать и собирать все компоненты, необходимые для эксперимента. Затем собирается конструкция из одной молекулы для проведения экспериментов. Первые две микросферы, покрытые ленточным титином, улавливаются двойным оптическим пинцетом в первом канале.

Затем две захваченные бусины перемещаются во второй канал, чтобы обеспечить прикрепление матрицы ДНК, помеченной биотином, на обоих концах. Наличие одной молекулы ДНК проверяется в третьем канале с помощью анализа силы удлинения ДНК. Наконец, конструкция шарика ДНК, называемая ДНК-гантелью, перемещается в белковый канал, где присутствует флуоресцентно меченный белок репрессора лактозы.

Получены результаты, которые показывают диффузию и специфическое связывание одиночных молекул глаза LAC на одной растянутой молекуле ДНК, а также количественную оценку кинетических параметров движения глаз LAC. Основными преимуществами этой методики по сравнению с существующими методами работы с одной молекулой являются возможность контроля напряжения, приложенного к новой молекуле, возможность точного отслеживания движений связывающих белков по нанометровой стабильной точке, а также возможность работы вдали от покровной поверхности сна. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о взаимодействиях белковой ДНК, особенно о механике регуляции экспрессии генов, а также о динамике диффузии белка вдоль ДНК в механизмах поиска мишени.

Эта демонстрация этого метода очень полезна для демонстрации практических аспектов построения проточной ячейки, обработки образцов и сборки конструкции бисера ДНК. В этом видео сначала будет показано, как проверить стабильность наведения двух улавливающих лазеров с помощью микрошариков, прикрепленных к поверхности скольжения крышки в качестве эталона. Подробную информацию о проектировании и изготовлении оптического пинцета можно найти в сопроводительном тексте протокола.

Используйте защитный лист размером 24 на 60 миллиметров, чтобы распределить два микролитра гранул кремнезема на поверхность защитного стекла размером 24 на 32 миллиметра. С помощью двух отрезков двустороннего скотча. Прикрепите защитное стекло размером 24 на 32 мм к предметному стеклу микроскопа, чтобы создать проточную ячейку.

Заполните проточную ячейку 50 миллимолярами фосфатного буфера и запечатайте ее изображением кремниевой смазки. Одна бусина кремнезема в светлопольной микроскопии при увеличении примерно в 2000 раз. Поле зрения должно быть примерно семь на пять микрометров, полученное на 7, 68 на 5, 76 пикселей, чтобы изображение шарика имело диаметр примерно 190 пикселей, компенсировать тепловые дрейфы с помощью программного обеспечения обратной связи, которое вычисляет положение XY от центра изображения и Z от дифракционных колец и корректирует дрейфы.

Перемещая пизостолик с нанометровой точностью или лучше, перекрывайте центр левой ловушки с центром бусины и измеряйте положение шума и его стандартное отклонение от квадрантного детектора, фотодиода или QDP. Повторите измерение для правильной ловушки. Стандартное отклонение позиционного шума должно быть в пределах нескольких нанометров, чтобы обеспечить точную локализацию ДНК-связывающих белков для создания проточной клетки.

Алмазный наконечник сначала используется для сверления отверстий диаметром один миллиметр в микроскопе размером 76 на 76 на один миллиметр. Сдвиньте, чтобы создать четыре входных отверстия и одно выходное. Это позволит использовать до четырех параллельных буферных потоков.

Каждый из них содержит один из различных компонентов, необходимых для экспериментальных бусин, флуоресцентно меченный белок ДНК и буфер для визуализации. Очистите предметное стекло микроскопа этанолом и отцентрируйте порт со вставленным уплотнительным кольцом и клейким кольцом в предметное стекло, окружающее отверстия для доступа. На этом этапе важно надевать перчатки, чтобы избежать отпечатков пальцев, которые могут нарушить процесс склеивания.

С помощью второго зажима ползуна прикрепите нанопорты к предметному стеклу и поместите его в духовку, разогретую до 180 градусов Цельсия, на один час, чтобы обеспечить полное крепление. Тем временем нарисуйте на листе бумаги контур ячейки потока. Канал должен быть шириной примерно три миллиметра и совпадать со всеми положениями на предметном стекле микроскопа.

Поместите рисунок поверх двух кусков перфила и с помощью скальпеля сделайте резкие и непрерывные надрезы по нарисованному контуру. Удалите все образовавшиеся выпуклости, выбросьте нижний слой отдушки, который как раз и используется для обеспечения чистой поддержки. Затем поместите предметное стекло микроскопа с прикрепленными нанопортами вверх дном в металлическую подставку.

Тщательно совместите контур камеры параформы с отверстиями, следя за тем, чтобы параметр не выдавливал входы и выходы крышки камеры с помощью очищенного стекла крышки микроскопа и тщательно удалите излишки параметров, окружающих камеру. Поместите два тепловых блока, предварительно нагретых до 120 градусов Цельсия, на верхнюю часть проточной ячейки, чтобы оказать на нее равномерное давление. Дайте пара-пленке растаять примерно 25 минут.

Следующим этапом является подготовка напорного резервуара и буферных емкостей. Напорный резервуар изготовлен из оргстекла и позволяет разместить до шести буферных контейнеров. Сначала подсоедините запорные клапаны на выходе из буферных емкостей для включения буферного потока с рычагом клапана в вертикальном положении или выключенным в положении по часовой стрелке.

Во время экспериментов проточную ячейку устанавливают на предметный столик микроскопа. Затем подсоедините запорные клапаны через полиэфир, эфиркетон или пиковую трубку, а также бесфланцевые спиннинги к входным отверстиям проточной камеры. Пиковая трубка имеет внутренний диаметр примерно 150 микрометров километров, примерно три сантиметра фторированной этиленпропиленовой трубки с внутренним диаметром примерно 500 микрометров используются в качестве связующего звена между пиковой трубкой и нанопортовыми узлами проточной ячейки.

Это необходимо для уменьшения буферного потока на входе в камеру, чтобы избежать поломки проточной ячейки или отсоединения нанопорта от стекла. С другой стороны, использование только трубок большого внутреннего диаметра потребовало бы больших объемов биологических образцов. Подсоедините выходное отверстие проточной камеры к открытой трубке Falcon при атмосферном давлении.

Эта трубка служит для утилизации буфера, выходящего из проточной камеры. Чтобы начать эту процедуру, добавьте по одному миллилитру буфера А в каждую из буферных емкостей и приложите давление 200 миллибар для промывки соединительных трубок и проточной ячейки. Предусмотрена возможность установки системы контроля давления.

Наконец, регулировка давления воздуха внутри напорного бачка. Проверьте наличие пузырьков воздуха, которые могут нарушить плавность потока. Легкое прикосновение к выпускной трубке поможет удалить оставшиеся пузырьки, снизить давление до 20 миллибар и убедиться, что все каналы и трубки очищены от пузырьков воздуха и что буфер течет с одинаковыми скоростями во всех каналах.

Подготовьте образцы до конечного объема 300 микролитров. В этом эксперименте используются полистирольные шарики с стрептетным покрытием, линейная ДНК, биотинилированная на обоих концах, которая содержит специфические последовательности-мишени для связывания лактозного репрессора, и флуоресцентно меченный белок лактозы. Добавьте каждый образец в одну из емкостей шприца в следующем порядке: шарики в первом канале, ДНК во втором, буфер для визуализации в третьем и меченый белок в четвертом канале.

Включите поток на 20 миллибар и откройте запорные клапаны, чтобы образцы могли поступать внутрь проточного канала. Это легко обнаружить в канале валика. При съемке первого канала при светлопольном освещении включите два оптических пинцета и поймайте шарик полистирола в каждую ловушку.

Быстро переходите ко второму каналу, чтобы другие бусины не попали в ловушки. Обратите внимание, что приход в канал ДНК легко заметен по окончанию потока шариков. Используя один оптический дефлектор AO или ход OD, одна бусина ловит вперед и назад в непосредственной близости от другой бусины, чтобы обеспечить прикрепление расширенной ДНК потока между двумя оптически захваченными бусинами.

Когда гантель из ДНК формируется, статичная бусина начинает следовать за движением бусины, которая активно перемещается вперед и назад с помощью ловушки. Быстро перейдите к буферному каналу и выключите буферный поток. Выполните анализ кривой удлинения силы, чтобы проверить наличие одной молекулы ДНК.

Это достигается путем разделения двух бусин при измерении натяжения ДНК. Как только будет получена одна гантель из ДНК, снова включите поток и переместите гантель к белковому каналу. Переключитесь на широкопольную флуоресцентную микроскопию, чтобы контролировать взаимодействие меченого белка-репрессора лактозы с ДНК, выключите поток и начните сбор данных.

Этот метод позволяет обнаруживать одиночные молекулы репрессора лактозы или лака глаза, взаимодействующие с растянутой молекулой ДНК. В этой репрезентативной CH-аграмме одна молекула глаза lac диффундирует вдоль неспецифических последовательностей ДНК, в то время как другая молекула глаза lac специфически связана с одним оператором, расположенным в центре молекулы ДНК. На этом графике показано положение двух молекул лакового глаза вдоль направления, соединяющего центры двух ловушек.

В зависимости от времени, положения молекул были определены с помощью алгоритма центра радиальной симметрии, показанного здесь, представляет собой график среднего квадратичного смещения или MSD в зависимости от времени для одной молекулы лакового глаза, диффундирующей вдоль растянутой молекулы ДНК. Коэффициент диффузии белка может быть легко получен из линейной регрессии данных. Комбинация манипуляций и методов визуализации является мощным методом, позволяющим осуществлять механический контроль на одном биологическом полимере, таком как D-N-A-R-N-A или цитоскелетная нить, и одновременную локализацию отдельных белковых молекул, взаимодействующих с самим полимером.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что сочетание манипуляций с одиночными молекулами и методов визуализации требует тщательного проектирования экспериментальной установки для обеспечения стабильности взвешенного полимера на нанометровом уровне. С другой стороны, необходима правильная конструкция биологического зонда, чтобы гарантировать специальное разделение между улавливающим G-лазером и флуоресцентным зондом. Пожалуйста, обратитесь к сопроводительному тексту протокола для получения подробной информации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собрать молекулу ДНК между двумя оптическими быстрыми ударами по сборке этой конструкции. Это лучше всего получается с многоканальной ячейкой потока, для которой мы предоставили подробное описание. Мы также указали, как оптимизировать буферный поток и удалить пузырьки воздуха, которые в противном случае могли бы поставить под угрозу ваши эксперименты.

В комбинированном текстовом протоколе вы можете найти протоколы для мечения ДНК с помощью биоТЭ, который необходим для сборки с покрытыми стрептавидином ритмами, а также протоколы для мечения белка. Наконец, мы проиллюстрировали пошаговые операции по количественной оценке связывания и диффузии одного репрессивного белка лактозы на растянутой молекуле ДНК.