Определение спонтанную двигательную активность в
10 апреля 2014 г.
Дрозофилы полезны в изучении генетических или экологических манипуляций, которые влияют на поведения, такие как спонтанной двигательной активности. Здесь мы опишем протокол, который использует мониторы с инфракрасными лучами и анализа данных программного обеспечения для количественного спонтанной двигательной активности.
Общая цель данной процедуры заключается в количественной оценке спонтанной локомоторной активности плодовых мушек. Для этого сначала проводят сбор и выдержку экспериментальных мушек по возрасту. Вторым этапом является установка мониторов популяции в инкубаторе с контролируемой температурой и загрузка соответствующего программного обеспечения.
Затем мух переносят в стеклянные флаконы, после чего помещают их в мониторы популяций для запуска мониторинга активности. Заключительным этапом является анализ данных. В конечном итоге мониторы популяций используются для выявления различий в спонтанной физической активности мух.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как негативная геоаксис, является то, что он позволяет осуществлять простой, надежный и объективный непрерывный мониторинг спонтанной физической активности нескольких популяций мух. Этот метод может помочь нам определить, как различные манипуляции влияют на мух. Демонстрацией процедуры спонтанной физической активности займется Сюзанна Ковски, лаборант лаборатории. Для начала приготовьте корм в соответствии с этапами, описанными в сопровождающем текстовом протоколе, и дайте ему остыть при постоянном перемешивании на плитке.
Отмерьте по 5 мл корма в каждую узкую стеклянную виалу, следя за тем, чтобы уровень корма был ниже самого нижнего кольца популяции. Проведите мониторинг после того, как корм остынет до комнатной температуры. Закройте виалы спонжевыми пробками и храните их при температуре 4 °C до двух недель.
Перед использованием прогрейте виалы до комнатной температуры. Затем вырастите мух линии Canton S в пластиковых виалах на стандартной лабораторной среде. Содержите виалы в увлажненной термостатируемой камере при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота.
Утром удалите взрослых мух из флаконов. Затем в течение восьми часов после выхода из куколки разделите новых мух по полу на CO₂-анестезирующей площадке, чтобы гарантировать, что самки являются недопаренными. Подготовьте 10 флаконов с родительскими мухами, поместив в каждый недопаренных самцов и самок в возрасте от 5 до 10 дней.
Мухи в стандартном флаконе с кормом и несколькими зернами дрожжей. Содержите мух в инкубаторе при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота в течение двух дней. Пересаживайте мух в новый пластиковый флакон через день и храните флаконы с полученными яйцами в инкубаторе при температуре 25 °C.
Затем удалите мух, которые вылупились в течение первого дня, и верните пробирки в инкубатор, чтобы собрать более синхронизированную популяцию мух на второй день. Далее, используя CO₂-анестезатор, быстро соберите в каждую пробирку по 25 самцов и 25 самок с помощью металлической ложки в течение 24 часов. Запишите день ELO на пробирке.
Подготовьте не менее пяти повторностей в пробирках для каждой из экспериментальной и контрольной групп. Содержите пробирки в термостатах с контролируемыми условиями среды при температуре 25 °C и 12-часовым циклом свет/темнота.
Пересаживайте мух в новый пластиковый флакон каждые два дня в течение 10 дней. С помощью воронки поместите мониторы популяции в инкубатор с регулируемой температурой. Затем подключите каждый монитор к блоку интерфейса питания (PSIU) четырехжильным телефонным кабелем через пятиконтактный разветвитель.
Затем подключите телефонный кабель к PSIU. Подключите PSIU к розетке электропитания с напряжением от 100 до 240 В, а выходной разъем блока питания вставьте в один из соответствующих разъемов PSIU. Затем загрузите USB-программное обеспечение, используемое PSIU для установления канала передачи данных между компьютерной программой, PSIU и мониторами активности.
Запустите программу. Затем в разделе настроек выберите последовательный порт PSIU для Macintosh.
Затем выберите интервал считывания. Далее выберите мониторы по их уникальному заводскому номеру. Выберите диапазон мониторов, который соответствует присвоенным им номерам.
Убедитесь, что все мониторы подключены правильно, проверив наличие зеленого индикатора. Красный индикатор указывает на потерю соединения. Черный квадрат означает, что система выключена или USB-соединение установлено неправильно.
Отберите самцов и самок мух одного возраста. С помощью камеры с углекислым газом поместите по 10 самцов и 10 самок в отдельные стеклянные виалы комнатной температуры.
Используйте не менее трех флаконов для каждой экспериментальной и контрольной линии. Для мух обоих полов держите флаконы на боку до тех пор, пока насекомые не восстановятся после воздействия углекислого газа, чтобы они не завязли в корме. Оставьте их на два часа при комнатной температуре для восстановления после воздействия оксида углерода. Затем поместите флаконы в популяцию.
Мух-мониторов содержат в инкубаторах. Через три или четыре дня пересаживают мух в новые пробирки, чтобы предотвратить высыхание корма. По окончании эксперимента проводят сканирование данных для удаления дубликатов и проверки полноты записей.
Используя сканирование файла при 110 x, выберите интервал сбора данных и удалите данные, собранные в течение первых 24 часов выбранного периода времени. Программа передаст текущее общее количество отсчетов для каждого монитора на компьютер и начнет отсчет заново с нуля. Затем выберите название эксперимента и скопируйте файлы из папки данных компьютера для сохранения данных.
Начните анализ данных с тщательного переноса данных, собранных в текстовых файлах, в столбцы таблиц Excel. Затем рассчитайте общую активность за выбранный период времени для каждого монитора, которая представляет собой сумму активности, зафиксированной на трех разных высотах инфракрасных лучей. В завершение определите среднюю локомоторную активность и стандартное отклонение между тремя мониторами, представляющими три биологических повторности, используя двусторонний t-критерий Стьюдента.
Спонтанная локомоторная активность у drosophila зависит от пола мухи и цикла свет-темнота. Как показано на данном графике средней активности самцов и самок мух, стрелка отмечает переход от света к темноте. В области снижения активности общая активность 20-дневных самцов мух увеличивается, когда мухам дают половину порции стандартного корма при низкокалорийной диете, по сравнению со сниженной активностью мух при высококалорийной диете.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять спонтанную физическую активность дрозофил. Этот метод полезен для того, чтобы установить, как различные генетические или средовые манипуляции влияют на активность мух.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод количественного определения спонтанной локомоторной активности Drosophila melanogaster. Использование инфракрасных датчиков и программного обеспечения для анализа данных позволяет исследователям эффективно измерять физическую активность плодовых мушек в контролируемых условиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческая биология
- Генетика
Теоретические сведения
- Drosophila melanogaster служит модельным организмом для изучения поведения.
- Понимание локомоторной активности позволяет получить представление о генетических и средовых влияниях.
- Технология инфракрасного мониторинга обеспечивает точное отслеживание активности.
- Анализ данных имеет решающее значение для интерпретации паттернов локомоции.
Цель исследования
- Количественная оценка спонтанной локомоторной активности плодовых мушек.
- Оценка влияния генетических и средовых факторов на поведение.
- Предоставление стандартизированного протокола для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Сбор и старение экспериментальных особей Drosophila melanogaster.
- Установка мониторов популяции в инкубаторе с регулируемой температурой.
- Перенос мух в стеклянные флаконы для мониторинга.
- Запуск мониторов активности и анализ собранных данных.
Основные результаты
- Мониторы популяции позволяют эффективно количественно оценить различия в локомоторной активности.
- Анализ данных дает представление об уровнях спонтанной физической активности.
- Результаты могут быть использованы в будущих исследованиях поведения и генетики.
- Протокол является воспроизводимым и применимым к различным схемам экспериментов.
Выводы
- Данный метод обеспечивает надежный подход к изучению локомоторной активности плодовых мушек.
- Понимание этих форм поведения может расширить знания о генетических и средовых взаимодействиях.
- Протокол может быть адаптирован под различные исследовательские задачи в области нейробиологии и биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная оценка спонтанной локомоторной активности Drosophila melanogaster обеспечивает масштабируемый и объективный способ анализа генетического и средового влияния на поведение, что способствует валидации мишеней на ранних этапах исследований в области нейронаук и метаболических заболеваний. Данный метод позволяет снизить механистические риски путем установления связи между фенотипическими результатами и модуляцией сигнальных путей, обеспечивая прогностическую достоверность в рабочих процессах идентификации перспективных соединений. Воспроизводимость и возможность непрерывного мониторинга позволяют использовать этот метод в качестве платформы трансляционных биомаркеров для валидации доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения спонтанной физической активности в качестве функционального показателя целостности нейронных и метаболических путей.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет объективной и непрерывной количественной оценки локомоторного поведения при различных генетических условиях и воздействиях окружающей среды.
- Прогностическая ценность: облегчает сортировку портфеля препаратов путем выявления соединений или генетических манипуляций, которые значительно изменяют паттерны активности, что указывает на взаимодействие с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления базовых профилей локомоторной активности в контролируемых условиях.
- Воспроизводимость: Получение стандартизированных количественных данных с помощью инфракрасного лучевого мониторинга, что обеспечивает надежную оценку соединений в повторностях.
- Масштабируемость: Поддержка параллельного мониторинга нескольких флаконов для высокопроизводительного анализа фармакологических или генетических вмешательств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: моделирование патологических состояний человека путем оценки изменений локомоторной активности при генетических манипуляциях, имитирующих неврологические или метаболические расстройства.
- Трансляционная преемственность: связь поведенческих фенотипов, выявленных на этапе фундаментальных исследований, с доклинической валидацией посредством использования согласованных и количественно измеримых показателей активности.
- Принятие решений с учетом рисков: определение критериев для дальнейшего продвижения исследований путем корреляции сдвигов активности с модуляцией мишени, что снижает количество ложноположительных результатов при оптимизации ведущих соединений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинической валидации, обеспечивая поведенческую конечную точку, которая связывает понимание механизмов с фенотипическим результатом.
- Биология открытий: способствует уточнению путей передачи сигналов и валидации мишеней путем количественной оценки влияния генетических изменений или воздействия препаратов на спонтанную локомоторную активность.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет непрерывного многопараметрического отслеживания активности популяций мух.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных (общая активность, стандартное отклонение), что дает возможность проводить статистическое сравнение экспериментальных условий с помощью t-критерия.
- Трансляционные исследования: способствуют разработке биомаркеров, связывая изменения локомоторной активности с лежащими в их основе генетическими или метаболическими нарушениями, имеющими значение для моделей заболеваний человека.
- Корпоративное использование: функционирует как многократно используемая платформа для поведенческого скрининга, применимая в различных проектах в области нейронаук, метаболизма и исследований старения.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности путем прямого измерения спонтанной физической активности в качестве фенотипического якоря.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость с помощью калиброванного инфракрасного мониторинга и определенных рабочих процессов анализа данных.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя ранние количественные поведенческие данные, что снижает уровень биологического отсева на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков путем выявления воздействий, оказывающих значительный и воспроизводимый эффект на локомоторную активность.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, настройки поведенческих тестов и систем инфракрасного мониторинга.
- Зависит от мониторов популяции, интерфейса PSIU, инкубаторов с регулируемой температурой и программного обеспечения для сбора данных.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов старения мух, разделения по полу и подготовки флаконов.
- Требует учета особенностей адаптации для различных генетических линий, условий питания и фармакологического воздействия.
- Включает такие практические ограничения, как высыхание корма с течением времени и необходимость периодического пересаживания мух в новые флаконы для обеспечения достоверности данных.
