Производство концентрированных, на основе липидов Oxygen микропузырька эмульсий с высокой скоростью сдвига гомогенизации и последовательной концентрации

Общая цель данной процедуры заключается в производстве большого объема самособирающихся липидных микропузырьков кислорода или OMS для внутривенного введения кислорода. Это достигается с помощью гомогенизатора с высоким сдвигом и газонепроницаемого резервуара для изготовления и последовательного концентрирования OMS. На втором этапе используются модифицированные шприцы для экструзии эмульсии LOM, содержащей 70 объемных процентов кислорода.

Затем эмульсию концентрируют путем центрифугирования до получения кислородной пены с объемным содержанием кислорода 90%. Заключительным этапом является контроль качества путем расчета объемного процента кислорода и оценки распределения частиц по размеру с помощью метода светорассеяния. В итоге в результате гомогенизации при высоком сдвиге получают два литра OMS, содержащего 90% кислорода по объему.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами производства, такими как соникация и амальгамация, является то, что гомогенизация позволяет получать самособирающиеся микропузырьки в литровых объемах, что необходимо для испытаний терапевтической доставки кислорода на крупных животных. Одним из применений данного метода является лечение пациентов с тяжелой гипоксемией, поскольку заполненные газообразным кислородом микропузырьки переносят кислород к дезоксигемоглобину в течение нескольких секунд и обладают содержанием кислорода, в три раза превышающим содержание кислорода в крови Visual. Демонстрация этого метода важна с учетом глубины погружения головки гомогенизатора.

Поддержание чисто окислительной среды и отделение концентрированных LMS от водной фазы могут быть труднодостижимыми задачами. Система для производства липидных кислородных микропузырьков или OMS состоит из резервуара для выдержки и концентрирования (HCT), оснащенного одноступенчатым смесителем, поточного гомогенизатора с высоким сдвигом, роликового насоса для перемещения жидкости между HCT и гомогенизатором, а также теплообменника.

Для начала настройки системы поместите под одноступенчатый миксер стерилизованный стеклянный сборный сосуд объемом четыре литра с широким горлом, оснащенный двумя нижними и тремя боковыми портами. Подсоедините к первому нижнему порту (порт №1) стерильную прозрачную трубку с внутренним диаметром 3/8 дюйма и длиной около 10 дюймов, оснащенную на конце трехходовым краном для сбора концентрированной эмульсии. Затем ко второму нижнему порту (порт №2) подсоедините стерильную трубку с внутренним диаметром 3/8 дюйма и длиной около 36 дюймов. Пропустите эту трубку через роликовый насос.

Входной патрубок гомогенизатора с высоким сдвигом оснащен тройником с двумя портами. Подсоедините трубку от порта номер два через роллерный насос к боковому порту тройника. Подключите другой порт к баллону с кислородом, используя расходомер для подачи кислорода с низким потоком.

Подсоедините выходной порт гомогенизатора с высоким сдвигом к входному порту поточного теплообменника, поддерживаемого при температуре 4 °C. Подсоедините выходной порт теплообменника к возвратному порту HCT, создав систему с замкнутым контуром. Подключите баллон с кислородом через расходомер к HCT через порт номер четыре.

Наконец, к верхнему порту HCT подсоедините монитор состава газа, открытый в атмосферу. Чтобы начать выполнение данной процедуры, поместите 20 г GMP, один из вариантов: DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE или DSPC, и 10 г холестерина в основание HCT. Добавьте в HCT один литр plasma light A и перемешивайте вручную в течение одной минуты, максимально интегрируя липиды в водную фазу.

Опустите одноступенчатый миксер в водную фазу, убедившись, что головка миксера полностью погружена в водную фазу. Чтобы предотвратить загрязнение свободного пространства над жидкостью окружающим воздухом, используйте резиновые уплотнители или ленту, чтобы обеспечить газоплотность верхней части HCT и отсутствие открытых боковых портов. Включите источник газа, подключенный к порту номер четыре, и подождите, пока доля кислорода в свободном пространстве HCT не превысит 95%. С помощью одноступенчатого миксера перемешивайте эмульсию-предшественник в течение пяти минут. При 5,000 RPM полученная смесь должна иметь бледно-белый цвет и не содержать видимых липидных комочков.

После смешивания неиспользованную водно-липидную смесь можно хранить при температуре 4 °C до 30 дней перед однократным использованием. Заполните всю систему замкнутого контура эмульсией-предшественником, включив роликовый насос, установив скорость потока 1,3 liters per minute или LPM. После заполнения системы оставьте насос включенным при скорости 1,3 LPM, чтобы начать производство LO.

Включите поточный гомогенизатор с высоким сдвигом на 7, 500 RPM. Сразу после этого подайте поток кислорода на входную часть гомогенизатора со скоростью 0.5 LPM. Оставьте одноступенчатый смеситель в HCT включенным на 3, 500 RPM.

ОМС образуются на границе раздела лопастей ротора и сеток для эмульгирования внутри поточного гомогенизатора. В течение первых нескольких минут жидкость должна стать заметно более вязкой. Запустите систему на 15 минут, после чего выключите гомогенизатор с высоким сдвигом и подачу кислорода в него.

Это предотвращает фазовое разделение и сохраняет относительную однородность продукта внутри HCT. Обратите внимание, что объем газонаполненной эмульсии должен увеличиться примерно в два-три раза в фазе последовательного концентрирования. Шприцы с люэр-локом объемом 140 мл для сбора полученных OMS были предварительно модифицированы путем забора 100 мл воздуха в шприц с последующим отпиливанием излишков поршня и корпуса шприца выше отметки 140 мл.

Присоедините стерильный модифицированный шприц к стоп-крану, установленному в базовый порт №1 собирающего сосуда; с помощью зубчатого пинцета опустите поршень и наберите 100 мл жидкости, затем плотно закройте шприц колпачком. Повторяйте процедуру до полного удаления жидкости. Центрифугируйте шприцы с направленным вниз закрытым концом в охлаждаемом стакане центрифуги при 225 ×g в течение 10 минут. После центрифугирования будут видны три слоя материала; удалите и утилизируйте нижний слой избыточной мутной водной фазы.

Второй слой ярко-белого цвета и содержит концентрированные oms. Перенесите концентрированную пену в газонепроницаемый стеклянный шприц, используя трехходовой кран, чтобы предотвратить загрязнение газами из окружающей среды. Удалите последний слой, содержащий свободный кислород из разорванных oms.

Качество пены можно оценить путем расчета концентрации газа следующим образом. Пена высокого качества должна иметь концентрацию газа больше или равную 90 об. %; в качестве второго контроля качества размер микропузырьков определяется методом оптического рассеяния света, чтобы убедиться, что размер частиц находится в ожидаемом диапазоне. Следует отметить, что изменение времени гомогенизации или состава может повлиять на размер пузырьков; стеклянные шприцы с концентрированными oms должны быть плотно закрыты колпачками.

При использовании соединений типа Luer-Lock шприцы можно хранить при 22 °C, 4 °C или -20 °C. Более низкие температуры могут обеспечить повышенную стабильность при хранении. С помощью данного протокола до двух литров концентрированного OMS можно изготовить за 90 минут.

Визуализация образца OMS объемом 10 µL с помощью световой микроскопии выявила сферические OMS, а также относительное количество липидного детрита. При анализе того же образца OMS методом оптического рассеяния средний диаметр частиц составил 2.624 ± 0.332 µm. Более 90% OMS имели диаметр менее 10 µm, а популяция была полидисперсной.

Вязкость эмульсии сильно зависела от газовой фракции и, следовательно, от концентрации микропузырьков. Аликвоты эмульсии LOM объемом 2 мл с объемным содержанием газа 60, 70 и 90% изучали методом измерения установившегося потока с использованием параллельных пластин диаметром 40 мм.

При изменении напряжения от 0,1 до 1000 паст OMS, содержащих 60 объемных процентов газа, геометрия демонстрировала радиологический профиль, сходный с профилем человеческой крови. Содержание кислорода в OMS проверяли путем добавления различных объемов кислорода, содержащегося в 60 объемных процентах OMS, к аликвотам десатурированной человеческой крови с известным дефицитом кислорода. Соотношение между объемом кислорода, добавленного в составе OMS, и объемным увеличением содержания кислорода в крови составило 1,053 ± 0,03025.

Это свидетельствует о том, что протестированные OMS содержат почти 100% кислорода, имеют малое количество захваченных газовых пузырьков и эффективно переносят весь свой запас кислорода в человеческую кровь in vitro. После освоения данной методики при условии её правильного и эффективного выполнения можно производить два литра LMS за 90 минут. При выполнении данной процедуры важно не забывать проводить визуальный контроль накапливающихся OMS и осуществлять контроль качества при концентрировании пены LOM. После завершения этого процесса производства OMS могут быть использованы для крупномасштабного внутривенного введения и доставки терапевтических газов.