Супер-Resolution Imaging из Cytokinetic Z Кольцо в живых бактерий Использование быстрого 3D-Structured Illumination микроскопии (F3D-SIM)

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за динамическими изменениями белка FTSZ во время деления клеток у бактерий. Это достигается путем нанесения тонких клеток бациллы, экспрессирующих слияние FTS указанного GFP, на поверхность небольшой подушечки aros. Затем прокладка переворачивается и переносится в чашку Петри со стеклянной крышкой-скользким дном.

Второй шаг заключается в получении покадровых изображений бактерий во время деления клеток с помощью 3D-микроскопии со структурированным освещением или системы визуализации 3D SIM. Затем оценивается качество исходных данных и отбрасываются изображения со снижением интенсивности более чем на 30% из-за фотообесцвечивания. Заключительным этапом является количественный анализ изменений локализации белка во время деления клетки путем измерения распределения интенсивности флуоресценции белка F-T-S-Z-G-F-P с течением времени.

В конечном счете, быстрая 3D SIM используется для того, чтобы показать, насколько динамичны дионные белки во время деления клеток у бактерий. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, заключается в том, что мы получаем трехмерную информацию об изменениях, происходящих при делении клеток в живых клетках. Хотя этот метод дает представление о бактериальном цитокинезе, он также может быть применен к другим системам, где мы хотим изучить динамические изменения белков, таких как клетки млекопитающих.

Впервые у нас появилась идея об этом, когда мы увидели традиционные 3D-изображения фиксированных бактериальных клеток, показывающие, что белок FDZ не был равномерно распределен по кольцу zed. Мы хотели дополнительно изучить, связано ли это распределение с изменениями, произошедшими во время сужения кольца Зеда. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этой техникой, испытывают трудности из-за неспособности сопоставить показатель преломления масла с образцом, и это приводит к низкому качеству изображений.

Чтобы подготовить самые тонкие клетки бациллы к визуализации, выращивайте клетки до середины экспоненциальной фазы, как описано в текстовом протоколе. Затем прикрепите клейкую рамку к стандартному предметному стеклу стеклянного микроскопа, предварительно сняв тонкий лист полиэстера. Затем нанесите открытую клейкую поверхность рамки на поверхность предметного стекла микроскопа, чтобы эффективно создать квадратный колодец поверх предметного стекла, оставьте толстый лист полиэстера прикрепленным к раме, чтобы предотвратить прилипание покровного стекла на последующих этапах.

Далее растопите раствор ароса в микроволновой печи до закипания пипеткой 67 микролитров расплавленного ароса в клеевую рамку. Сразу же положите крышку сверху на арос, чтобы создать ровную поверхность, и оставьте при комнатной температуре на пять-10 минут. Снимите крышку на одну-две минуты, пока образец собран.

Соберите один миллилитр аликвоты образца после центрифугирования при 8 000 об/мин в течение секундного сцеживания надосадочной жидкости, ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах свежей среды. Возьмите 2,5 микролитра концентрированного образца и нанесите пипетку на заранее подготовленную подушечку. Равномерно распределите образец по ровной поверхности подушечки aros.

Затем снимите клейкую рамку со предметного стекла микроскопа с помощью пинцета, не касаясь подушечки aros. Перенесите прокладку aros из микроскопа. Сдвиньте к чашке Петри диаметром 35 миллиметров со стеклянной крышкой, сдвиньте дно.

Для получения изображений с высоким разрешением. Переверните прокладку ароса так, чтобы суспензия ячейки соприкасалась с крышкой чашки Петри. В день эксперимента включите систему визуализации OMX 3D SIM не менее чем за час до начала эксперимента, чтобы система и лазеры полностью стабилизировались.

Затем включите различные компоненты, перечисленные в текстовом протоколе, на рабочей станции главного контроллера. Откройте программное обеспечение OMX, нажав на значок. Задайте путь к файлу для сохранения данных в соответствующую папку с данными.

Затем запустите программное обеспечение для мягкой работы. Включите необходимые для экспериментов лазеры на главном экране в разделе световых параметров. Активируйте камеру FITC из меню выбора канала и перейдите к проверке параметров, перечисленных в текстовом протоколе.

Нанесите каплю масла на верхнюю часть цели. Поместите образец чашки Петри, содержащей подготовленные ячейки, во вставку предметного стола и накройте круглой нагревательной крышкой. Опускайте ступень до тех пор, пока масло не коснется дна чашки Петри для образца.

Дайте чашке нагреться в равновесном состоянии в течение 15 минут В стадии с низкой экспозицией сфокусируйтесь на образце с помощью элементов управления столиком с нанопозиционированием. Сфокусируйтесь вверх и вниз по образцу, чтобы определить, равномерно ли распространяется свет выше и ниже фокальной плоскости образца. Затем используйте размер шага 0,5 микрона и отметьте верхнюю и нижнюю части стопки изображений, прежде чем вернуться к середине образца на вкладке эксперимента, нажмите кнопку «Получить толщину», чтобы задать толщину выборки.

Определите максимальное значение интенсивности образца изображения с текущей экспозицией и процентом параметров пропускания света. Это значение находится под окном изображения. Для цейтраферной съемки отрегулируйте экспозицию и процент пропускаемого света, чтобы получить максимальную интенсивность от 1100 до 1400.

На заднем плане. Для изображения активируйте раздел интервальной съемки на вкладке эксперимента. Установите необходимую частоту кадров и общее время в файле данных.

Введите соответствующее имя файла. Нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать получение изображения в начале его получения. Обратите внимание на максимальное значение интенсивности изображения в начале получения изображения для первого кадра временного ряда.

В конце захвата первого кадра убедитесь, что интенсивность сигнала через Zack не снизилась более чем на 10% для этого первого кадра. В конце захвата временного ряда откройте полученный файл исходного изображения с суффиксом DV и убедитесь в уменьшении максимальной интенсивности сигнала от начала временного ряда до конечного изображения. Отбросьте все временные точки, в которых произошло обесцвечивание фотографий более чем на 30% из меню процесса, активируйте окно реконструкции СИ.

Используйте существующие настройки для всех параметров. Активируйте используемую для канала специфичную кнопку OTF и установите стандартный набор фильтров. Активируйте используемую кнопку KO для конкретного канала и установите стандартный набор фильтров.

Перетащите необработанный файл в пространство входных файлов. Нажмите «Сделать это». Изучите распределение FTSZ вокруг Z-кольца для создания 3D-графиков интенсивности.

Затем откройте файл 3D-изображения. Чтобы просмотреть отдельные z срезов. Используйте инструмент просмотра громкости, расположенный на вкладке меню вида.

Чтобы обрезать область интереса, введите номер окна для этого 3D-изображения в окне ввода и введите новый и неиспользуемый номер окна в окне вывода. Кнопка выбора региона станет доступной для обрезки отдельного кольца Z из исходного поля зрения 40 на 40 микрон. Отрегулируйте нужную ось и степень поворота во вкладке вращения.

Нажмите кнопку «Сделать это». Прокрутите объем, чтобы получить желаемую перспективу, кольцо Z. Используйте инструмент инспектора данных для настройки размеров строк столбцов для создания новой области интереса вокруг отдельного Z-кольца.

Щелкните по центру изображения, чтобы расположить эту новую область интереса. Данные текстового изображения представляют собой автоматически сгенерированную таблицу, в которой отображается интенсивность флуоресценции каждого пикселя в пределах интересующей области. Нажмите кнопку 3D-графика, чтобы первоначально просмотреть график интенсивности.

Кроме того, данные текстового изображения можно экспортировать, нажав кнопку «Сохранить данные таблицы». В меню «Файл» скопируйте данные изображения из сохраненного текстового файла в новую таблицу. Выделите все ячейки в таблице и создайте новый 3D-график поверхности.

Отформатируйте 3D-график интенсивности для публикации для покадровой съемки. Повторите эти шаги для каждой из различных временных точек из файла 3D-изображения. При визуализации с помощью обычной широкопольной флуоресцентной микроскопии Z-кольцо выглядит как одна поперечная полоса флуоресценции в тонких бациллах.

Интенсивность флуоресценции по всей этой полосе равномерна. Схема локализации дает мало информации о структурной организации и распределении полимеров FTS в кольце, здесь исследуются те же клетки. С помощью метода FAST 3D sim

Вращение изображения 3D-модели вокруг оси Z позволяет визуализировать Z-кольцо как подлинную кольцевую структуру в трехмерном пространстве. Улучшение разрешения позволяет визуализировать неоднородное распределение FTSZ в кольце. Дополнительные примеры Z-колец Bacillus, визуализированных с помощью этого метода, иллюстрируют, что интенсивность флуоресценции вокруг Z-кольца никогда не бывает одинаковой.

Кроме того, наблюдаются области с очень низкой интенсивностью флуоресценции или промежутки. Для количественной оценки этих наблюдений были созданы 3D-графики интенсивности кольца Z. Графики интенсивности показывают, что величина флуоресценции может изменяться до четырех раз в разных областях тончайшего Z-кольца бациллы.

3D-графики интенсивности показывают, что промежутки почти считывают базовые уровни фоновой флуоресценции для анализа динамических изменений, происходящих внутри кольца Z. Со временем выполняется таймлапс 3D sim. В этом фильме показано, как FTSZ внутри тонкого Z-кольца бациллы постоянно меняется и измеряется с помощью графика интенсивности, который генерируется для каждого изображения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выращивать и препарировать бактериальные клетки, как визуализировать их с помощью 3D Sim, как анализировать их для получения количественных данных и, наконец, как обеспечить качественное изображение. Во время получения изображений очень важно следить за здоровьем ваших клеток, а также контролировать уровень экспрессии флуоресцентного белка во время получения После его развития. Этот метод проложил путь другим людям в области бактериальной клеточной биологии к использованию других методов микроскопии сверхвысокого разрешения и локализации других бактериальных белков в различных организмах.

После этой процедуры могут быть выполнены другие формы микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как фотоактивируемая локализационная микроскопия, чтобы посмотреть на динамические изменения в указанном белке FDS с течением времени.