Способ генерации легких нейтрофилия Использование аэрозольного липосахарид
15 декабря 2014 г.
Мы опишем метод индукции нейтрофилов воспаление легких на вызов аэрозольного липополисахарида распылением, для моделирования острого повреждения легких. Кроме того, основные хирургические методы для выделения легких, интубации трахеи и бронхоальвеолярного лаважа, также описаны.
Общая цель этой процедуры заключается в создании последовательной и воспроизводимой нейтрофилии дыхательных путей путем воздействия аэрозольного ЛПС. Это достигается путем предварительной загрузки ЛПС, взвешенного в физиологическом растворе, в небулайзер, подключенный к экспонировочной камере. Затем мышей подвергают воздействию аэрозольного ЛПС, а затем собирают бронхоальвеолярный лаваж и подсчитывают воспалительные клетки в лаваже.
Наконец, легочная ткань фиксируется, формально для встраивания, среза и иммуногистохимического анализа. В конечном счете, общее и дифференциальное количество клеток бронхоальвеолярного лаважа может быть использовано для оценки рекрутирования нейтрофилов в легкие. Основными преимуществами этого метода по сравнению с существующими методами, такими как интратрахеальное введение ЛПС, являются равномерное распределение аэрозольного ЛПС по всем легким, простота выполнения и минимальная подготовка, необходимая для успешного применения. изготовитель.
Далее с помощью воздушного фильтра подключите выходное отверстие небулайзера к массовому расходомеру, а затем подключите массовый расходомер к электросети. Отрегулируйте расход воздуха до пяти литров в минуту, поддерживая давление на уровне одного-двух бар, а затем снимите массовый расходомер и отключите воздушный поток. Далее подсоедините выходное отверстие небулайзера к разветвляющейся трубке диаметром 15,9 мм, соединенной с ящиками из плексигласа 2 1 1 50 на 2 0 5 мм, оснащенными съемными крышками.
Каждый ящик должен иметь пятимиллиметровое отверстие сбоку, противоположную входному отверстию, чтобы предотвратить нарастание давления. Теперь поместите до пяти мышей в каждую коробку и закройте крышками. Затем откройте небулайзер.
Заполните вкладыш от четырех до восьми миллилитров LPS, растворенного в физрастворе или только в солевом транспортном средстве, и снова подключите входное отверстие к системе подачи воздуха. Позвольте аэрозолю течь в закрытые коробки из плексигласа с постоянным наблюдением за животными и убедившись, что подача воздуха остается плотно закрепленной на входе небулайзера во время аэрозолизации. Через 10 минут отключите подачу воздуха и оставьте животных в ящиках из плексигласа еще на две минуты.
Затем откройте крышки. Дайте аэрозолю рассеяться и верните мышей в клетки в конечной точке эксперимента Для каждого животного по очереди сначала с помощью ножниц сделайте один передний задний надрез, чтобы обнажить грудную клетку. Затем поднимите грудную клетку за передний конец грудины и проколите диафрагму в самой вентральной точке, не разрезая легочную ткань.
Затем вскройте грудную клетку двумя надрезами, которые сходятся ниже челюсти в переднем заднем направлении. После того, как грудная клетка будет открыта, с помощью щипцов аккуратно раздвиньте ее и разрежьте трахею ниже гортани. Теперь поднимите трахею и разрежьте связки, соединяющие доли легких с грудной полостью.
Затем аккуратно потяните легкие и трахею вверх и в сторону от жировой и сердечной ткани и поместите их на лист упаковочной бумаги шприца. Далее вставьте в трахею полиэтиленовую трубку диаметром 0,965 миллиметра и закрепите ее нитью шелковой нити. Также завяжите многолепестковую пластину шелковой нитью, а затем вставьте иглу 23 калибра в полиэтиленовую трубку.
Затем для сбора бронхоальвеолярного лаважа с помощью одномиллилитрового шприца медленно ввести 250 микролитров льда, называемого стерильным PBS, в одну долю, а затем осторожно постучать легкими и о поверхность рабочего стола 30 раз медленно набрать жидкость обратно в шприц и собрать ее в пробирку, повторив процедуру с 200 микролитрами свежего PBS, Поместите бронхоальвеолярный лаваж на лед для последующего анализа. Чтобы зафиксировать легочную ткань для гистологического анализа, удалите мультидолю и защелкните. Заморозьте его на сухом льду.
Хранить мочку при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы зафиксировать ткань для гистологического анализа, установите шприц объемом 60 миллилитров без поршня на металлическую опорную стойку, засуньте одиночную долю формалином в течение пяти минут. Затем отсоедините иглу и потяните за шелковую нить, чтобы извлечь ее вместе с полиэтиленовой трубкой из трахеи.
Одновременное закрытие трахеи и удержание давления в легком. Затем погрузите долю в формин на 24 часа при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день промойте неподвижную ткань три раза в течение не менее 20 минут, каждый раз в 70% этаноле.
После встраивания обезвоженной ткани в парапленку разрежьте долю на срезы от четырех до пяти микрон и окрасьте срезы гематином и эоином для гистологической оценки. Общее количество клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа мышей, подвергшихся воздействию аэрозоля, образующегося только с помощью носителя, обычно составляет около или ниже 200 000 клеток. Клетки состоят из 95-100% мононуклеарных клеток с небольшим количеством лимфоцитов и без нейтрофилов.
Мышам вводили один миллиграмм на миллилитр аэрозоля. ЛПС. Тем не менее, демонстрируют повышенное общее количество клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, обычно превышающее 500 000 клеток через шесть часов, при этом клеточные инфильтраты остаются высокими через 24 часа, а клеточный профиль смещается в сторону преобладания нейтрофилов. Аналогичный воспалительный клеточный профиль и легочная нейтрофилия наблюдаются и при распылении пяти миллиграммов на миллилитр ЛПС.
Нейтрофилы наблюдались в эпителиальной подслизистой оболочке, а также в пространствах, окружающих проводящие дыхательные пути и кровеносные сосуды, после шести и 24 часов воздействия ЛПС, но не в контрольной группе. Мышей, обработанных солевым раствором. Общее содержание белка в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у мышей, подвергшихся воздействию ЛПС, увеличено по сравнению с мышами, подвергшимися воздействию физиологического раствора, а экспрессия нейтрофильного химического аттрактанта хемокинов c, XCL one и C XCL two также повышена у мышей, подвергшихся воздействию ЛПС.
Тем не менее, этот метод может дать представление о воспалении легких, вызванном ЛП. Он также может быть применен к другим моделям заболеваний, таким как бактериальные или вирусные инфекции, поскольку аэрозольный пар может быть адаптирован для решения множества различных задач.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод индукции нейтрофильного воспаления легких посредством небулизации аэрозолизированного липополисахарида (LPS) для моделирования острого повреждения легких. Также представлены основные хирургические методы изоляции легких, интубации трахеи и бронхоальвеолярного лаважа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Воспаление легких
- Острое повреждение легких
Теоретическая справка
- Аэрозольный LPS используется для создания модели изучения нейтрофильного воспаления.
- Бронхоальвеолярный лаваж позволяет собирать воспалительные клетки.
- Понимание механизмов привлечения нейтрофилов имеет решающее значение для изучения заболеваний легких.
- Данный метод обладает преимуществами перед традиционными методами введения LPS.
Цель исследования
- Для вызывания стабильной нейтрофилии дыхательных путей в контролируемых условиях.
- Для оценки рекрутирования нейтрофилов в легкие.
- Для совершенствования существующих методов индуцирования воспаления легких.
Используемые методы
- Загрузка LPS, суспендированного в физиологическом растворе, в небулайзер.
- Воздействие аэрозольного LPS на мышей в камере экспозиции.
- Сбор бронхоальвеолярного лаважа для подсчета количества клеток.
- Фиксация тканей легких для иммуногистохимического анализа.
Основные результаты
- Продемонстрировано эффективное привлечение нейтрофилов с использованием аэрозолизированного LPS.
- Предложен надежный метод оценки воспаления легких.
- Показаны преимущества в распределении и простоте применения по сравнению с интратрахеальными методами.
- Обеспечен детальный анализ воспалительных реакций в тканях легких.
Выводы
- Метод аэрозольного введения LPS является ценным инструментом для изучения воспаления легких.
- Данная методика позволяет получать воспроизводимые результаты в исследовательских условиях.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения терапевтических вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет воспроизводимо индуцировать пульмональную нейтрофилию — ключевой патологический признак острого повреждения легких и воспалительных заболеваний легких. Обеспечивая стандартизированную и недорогую систему аэрозольной доставки, этот метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в рамках программ раннего поиска препаратов, направленных на изучение патологии легких, опосредованной нейтрофилами. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, обеспечивая количественные показатели воспаления, значимые для терапевтического скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы привлечения нейтрофилов и хемокиновые пути, такие как CXCL1 и CXCL2, в условиях контролируемого воспаления.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную модель для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции путей при нейтрофильном воспалении легких.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели бронхоальвеолярного лаважа, включая общее и дифференциальное количество клеток, а также общий уровень белка для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Способствует разработке воспроизводимых конечных точек воспаления для скрининга соединений, модулирующих приток или активацию нейтрофилов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует соответствующее заболеванию нейтрофильное воспаление, наблюдаемое при остром повреждении легких у человека, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Практическая ценность: Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, обеспечивая последовательную оценку противовоспалительных соединений или соединений, модулирующих функцию нейтрофилов, в различных исследованиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в непрерывный процесс разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, что особенно актуально для программ, сосредоточенных на изучении легочного воспаления и повреждения тканей, опосредованного нейтрофилами.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о путях хемоаттракции нейтрофилов и модуляции воспалительного каскада в паренхиме легких.
- Скрининг: Позволяет создавать стандартизированное нейтрофильное воспаление для надежного скрининга соединений и валидации мишеней в моделях легочных заболеваний.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные бронхоальвеолярного лаважа (количество клеток, уровни белков, процент нейтрофилов) для сравнения воспалительных ответов при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Моделирует клинически значимое нейтрофильное воспаление легких у человека, обеспечивая преклиническую преемственность при изучении острого повреждения легких и связанных с ним показаний.
- Корпоративное использование: Создает недорогую платформу, не требующую специального обучения, для многократного использования в различных проектах по изучению воспаления легких или взаимодействий между хозяином и патогеном.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения вариабельности при индукции нейтрофильного воспаления.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированной аэрозольной доставке и минимальным требованиям к технической квалификации персонала.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем получения механистически релевантных и количественно определяемых воспалительных фенотипов на ранних этапах процесса поиска.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию соединений с учетом рисков на основе согласованных данных о привлечении нейтрофилов и экспрессии хемокинов.
Особенности реализации
- Требуется базовое обучение методам генерации аэрозолей, работе с мышами и технике бронхоальвеолярного лаважа.
- Требуется доступ к небулайзеру, источнику сжатого воздуха, экспозиционной камере из плексигласа и боксу биологической безопасности для работы с LPS.
- Для обеспечения сопоставимости результатов между различными исследованиями необходима стандартизация концентрации LPS, продолжительности экспозиции и условий содержания животных после экспозиции в разных лабораториях.
- При применении системы для доставки других аэрозольных агентов, таких как вирусные или бактериальные патогены, следует учитывать необходимость адаптации метода.
- Метод ограничен исследовательскими работами, не соответствующими стандартам GMP; он не подходит для регулируемых токсикологических исследований или производства клинических материалов без дополнительной валидации.
